微流控芯片电泳分离血清高密度脂蛋白亚类的研究-汶颢股份
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微流控芯片电泳分离血清高密度脂蛋白亚类的研究

高密度脂蛋白(HDL)是一种由脂质和蛋白质构成的,在形状、密度、颗粒大小、电荷和理化特性等方面都具有较大异质性的脂蛋白,它参与胆固醇逆运转,具有抗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)作用。HDL亚类成分可以作为评估AS的危险因素,与冠心病(CHD)密切相关,但对于亚类HDL2和HDL3的相对重要性问题在临床上一直存在分歧,国际上仍未得到统一认识,其中一重要原因是因为缺乏简易、准确的HDL亚类分析方法

微流控芯片电泳能够快速高效分离分析DNA氨基酸蛋白质细胞等,分离效率高、重复性好本研究利用自制的石英芯片结合激光诱导荧光(LIF)检测系统,在本研究组前期研究基础上进一步改良,可简便、高效分离出HDL亚类,并对健康体检者和CHD患者血清标本进行分析,初步探讨了微流控芯片电泳用于HDL亚类分析的临床应用价值

1材料和方法

1.1 标本来源

南通大学附属医院经冠状动脉造影证实的CHD患者、排除心脑血管疾病及其他影响血脂代谢疾病的健康体检者

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂浓度为15.5g/L的HDL标准品、Tricine、甲基葡胺(MEG)、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二醇、甲醇、磷钨酸PTA)、氯化镁(MgCl2)、溴化钾(KBr);硝基苯并噁二唑-C6-酰基鞘胺醇(NBDC6-ceramide);沉淀剂按照中华医学会检验学分会推荐的PTA-Mg沉淀法中描述配制(1.52mmol/LPTA、0.05mol/LMgCl2,pH6.1);样品缓冲液由40mmol/LTricine、50mmol/LMEG、0.2mmol/LSDS(pH8.5)组成;分离缓冲液由40mmol/LTricine、50mmol/LMEG、0.01mmol/LSDS(pH8.5)组成所用试剂均为分析纯,配制试剂用水为二次蒸馏水,试剂配置好后均用0.22滋m的滤膜过滤

1.2.2 仪器LIF检测系统(自行研制);OptimaTML-90K型超速离心机;7600-020全自动生化分析仪;CX系统电源(0~5000V)

1.2.3 自制芯片石英玻璃经光刻、湿法腐蚀、高温键合而成结构见图1整个芯片大小为64mm伊32mm,芯片微管道宽100滋m,深约25滋m,芯片样品池到十字交叉点长4mm,有效分离长度为42mm,储液池的直径为2mm样品池1和样品废液池2间通道用于进样,缓冲液池3和缓冲液废液池4间通道用于电泳分离

 Fig.1Structureforthemicrochip(a)Chip.(b)TheSEMphotographforthecross-pointchannel.


Fig.1Structureforthemicrochip(a)Chip.(b)TheSEMphotographforthecross-pointchannel.1:Samplereservoir;2:Samplewasterreservoir;3:Bufferreservoir;4:Bufferwasterreservoir.

1.3 方法

1.3.1 标本准备受试者素食3天后,清晨空腹采血3ml,以3000r/min离心10min后分离血清,所取血清标本加入同体积沉淀剂,充分混匀,置室温15min后3000r/min离心15min,离心后吸出上清液供测定要求4h之内完成分离检测,或-70℃保存HDL标准品预处理过程:1滋lHDL标准品加入10滋l去离子水,再加入4滋l0.2g/LNBDC6-ceramide(以v(乙二醇)∶v(甲醇)=9∶1混合液预先溶解)避光预染1min,最后加入60滋l样品缓冲液血清标本预处理过程:6滋l预测血清加入2滋l去离子水,再加入4滋l0.2g/LNBDC6-ceramide避光预染1min,最后加入20滋l样品缓冲液

1.3.2 电泳过程在芯片样品废液池、缓冲液池、缓冲液废液池中加入分离缓冲液,并使通道内充满分离缓冲液在样品池中加入样品,使激光束聚焦于芯片分离通道下检测点处按下列程序分别向4个储液池施加电压,进行进样和分离操作:进样45s,样品池、样品废液池、缓冲液池、缓冲液废液池分别施加760V、0V、300V和450V电压;分离4min,样品池、样品废液池、缓冲液池、缓冲液废液池分别施加500V、500V、3500V和0V电压运行温度25℃,分离电场强度为450V/cm.

1.3.3 电泳原理石英芯片微通道表面在缓冲液是碱性的情况下,硅羟基解离产生负电荷,缓冲液中阳离子在芯片管壁负电荷表面形成一圆筒形的阳离子鞘,在外加电场作用下,携带溶剂一齐向阴极迁移,便形成电渗流管道中HDL亚类的迁移速度是外加电场、溶剂阻力与电渗流作用的结果,由于电渗流的作用通常大于带电粒子所受电场力作用,所以样品粒子在管道进行与电渗流方向一致的差速迁移最后通过末端检测器的检测并记录得到电泳图谱

1.3.4 统计分析采用SPSS11.0软件进行统计学处理,数据用x依s表达组间差异比较使用方差分析,P<0.05有显著性差异

2结果

2.1HDL亚类的峰型鉴定

HDL标准品的电泳图谱见图2,HDL被分为2个区带(a,b区带),其出峰时间分别为1.5min和1.8min,4min内完成分离根据Havel等[10]报道的超速离心法制备HDL2和HDL3,HDL2加入到分析样品中b区带明显增高、面积增大,见图3;HDL3加入到分析样品中a区带明显增宽、面积增大,见图4可以判定快速迁移峰a为HDL3,慢速迁移峰b为HDL2

2.2沉淀剂处理前后血脂水平的测定

1为随机选取一健康体检者血清标本,生化分析仪测得的沉淀剂处理前后血脂水平沉淀剂处理后血清被2倍稀释,所以处理后测得指标乘以2

Fig.2EletropherogramoftheseparationofstandardHDLTheinjectionconcentrationofHDLwas80滋mol/L.Separationconditions:Samplebuffersolutioncontained0.2mmol/LSDS,40mmol/LTricine,50mmol/LMEGatpH8.5.Separationbuffersolutioncontained0.01mmol/LSDS,40mmol/LTricine,50mmol/LMEGatpH8.5,withEat450V/cm. 

Fig.2EletropherogramoftheseparationofstandardHDLTheinjectionconcentrationofHDLwas80滋mol/L.Separationconditions:Samplebuffersolutioncontained0.2mmol/LSDS,40mmol/LTricine,50mmol/LMEGatpH8.5.Separationbuffersolutioncontained0.01mmol/LSDS,40mmol/LTricine,50mmol/LMEGatpH8.5,withEat450V/cm.

Fig.3EletropherogramofthemixturesofstandardHDLand2滋gHDL2SeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2. 

Fig.3EletropherogramofthemixturesofstandardHDLand2滋gHDL2SeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2.

Fig.4EletropherogramofthemixturesofstandardHDLand2滋gHDL3SeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2. 

Fig.4EletropherogramofthemixturesofstandardHDLand2滋gHDL3SeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2.

Table1Theserumlipidlevelsofhealthysubjectsbeforeandaftertheserumtreatedbyprecipitatingagent

Table1Theserumlipidlevelsofhealthysubjectsbeforeandaftertheserumtreatedbyprecipitatingagent 

2.3临床血清HDL的分析

5、图6分别为健康体检者和CHD患者血清标本连续3次电泳分离结果全自动生化分析仪测得HDL-C浓度分别为1.78mmol/L和0.56mmol/L.

Fig.5EletropherogramsofthehealthysubjectanditsreproducibilitySeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2. 

Fig.5EletropherogramsofthehealthysubjectanditsreproducibilitySeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2.

Fig.6EletropherogramsofthepatientwithCHDanditsreproducibilitySeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2. 

Fig.6EletropherogramsofthepatientwithCHDanditsreproducibilitySeparationconditionswerethesameasdescribedinFigure2.

2.4CHD患者与健康体检者HDL亚类的峰面积

2为受试标本HDL2、HDL3峰面积的统计学结果,可见CHD患者HDL2(P<0.001)峰面积显著低于健康体检者组,CHD患者HDL3(P<0.001)峰面积显著高于健康体检者组,提示CHD患者HDL2有减少趋势,HDL3有增多趋势

Table2PeakareaofserumHDLsubclasses

Table2PeakareaofserumHDLsubclasses 

3讨论

微流控芯片电泳可方便实现小体积(nl)进样、分离等操作,还可在分离时施加常规毛细管电泳难以达到的高场强,能达到快速、高效分离微流控芯片电泳用于血清脂蛋白的分离分析是由Weiller等于2002年首次报道的,本研究组前期也有过基于微流控芯片电泳技术,利用自制的微芯片结合LIF检测系统3min内分离血清HDL、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白[6]的相关报道,重复性和稳定性均较好

HDL是由脂质(磷脂和游离胆固醇位于颗粒表面,胆固醇酯和三酰甘油位于核心)和蛋白质(载脂蛋白和多种少量其他蛋白质)组成的复杂大分子.HDL不同亚类可以根据其密度、颗粒大小、电荷及组成不同进行分离,分析方法主要有超速离心法梯度凝胶电泳法质子核磁共振光谱法免疫亲和层析法双向电泳-免疫印迹法等,但这些方法多半费时耗力,技术要求高,无法在临床上推广应用

本研究主要以微流控芯片电泳技术为平台,结合LIF检测系统,构建检测血清HDL亚类的方法研究中首先优化了实验条件Tricine、MEG缓冲液具有较宽的pH范围,在电泳过程中能够保持稳定的电渗流,使结果具有良好的重复性MEG还具有动态涂层作用,能部分消除管壁对蛋白质的吸附我们考察了MEG浓度对实验结果的影响,最后发现MEG浓度为50mmol/L,Tricine浓度为40mmol/L时,HDL得到了最佳分离效果脂蛋白颗粒在碱性溶液中带负电荷,电泳过程中,荷质比不同的脂蛋白组分在电渗流的驱动下实现分离,在极端pH时有利于电渗流,但同时极端pH易使蛋白质变性,影响检测结果我们对缓冲液pH进行优化,分别考察了pH值为7.8、8.0、8.2、8.5、8.8、9.2、9.8时HDL亚类的分离效果最后发现,pH为8.5时,HDL分离效率最高蛋白质吸附会严重影响分离效率和重复性,SDS是一种阴离子型表面活性剂,Ceriotti等[12]通过激光散射分析实验证实,样品溶液中存在低浓度的SDS时不会引起脂蛋白颗粒结构的改变,我们分别在样品缓冲液和分离缓冲液中添加了0.2mmol/L和0.01mmol/LSDS,有效提高了分离效率和分离度

实验中使用的沉淀剂按照中华医学会检验学分会推荐的PTA-Mg沉淀法中描述配制,原理是利用沉淀剂中大分子多阴离子化合物(磷钨酸盐)与两价阳离子(镁离子)沉淀血清中乳糜微粒、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和脂蛋白(a),离心后上清液中只含有HDL一种脂蛋白由表1可知,代表Table2PeakareaofserumHDLsubclassesCHD(n=18)Healthysubject(n=23)HDL20.285依0.039*0.552依0.096HDL31.394依0.091*1.108依0.074HDL3HDL2HDL3HDL2HDL3HDL20.30.60.91.21.51.82.12.42.73.03.33.63.9t/min0.0伊1000··221生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2010;37(2)HDL的指标HDL-C和载脂蛋白A1在沉淀剂处理前后几乎不变,而代表低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和脂蛋白(a)的另3个指标都近似0,由此断定离心后上清液中只含有HDL一种脂蛋白本实验中使用的荧光染料NBDC6-ceramide是一种能与脂蛋白颗粒特异性结合的染料,不受血清中其他物质干扰

5、图6分别为健康体检者和CHD患者血清HDL连续3次进样电泳图谱,HDL3和HDL2峰均得到基线分离,且重现性良好,图5、图6中HDL2峰的出峰时间和峰面积相对标准偏差分别为2.76%、2.92%和2.85%、2.93%,HDL3峰的出峰时间和峰面积相对标准偏差分别为2.15%、2.24%和2.17%、2.31%2为18例CHD患者血清标本和23例健康体检者血清标本的HDL亚类峰面积统计结果可见,CHD患者HDL2显著降低(P<0.01),HDL3显著升高(P<0.01),可能是因为CHD患者逆向转运胆固醇的能力降低,新生的HDL3较难转变为成熟的HDL在后续实验中,我们将进一步优化方法学,并选择合适的内标,争取快速简便完成定量测定

综上所述,本研究以微流控芯片电泳技术为平台,结合LIF检测系统,HDL亚类在4min内达到高效分离,重复性较佳,测试费用低廉,弥补了传统检测方法费时、繁琐等不足,具有较大的推广价值

文献来源生物化学与生物物理进展DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00506作者:郑慧斐丛辉王惠民(转载仅供参考学习及传递有用信息,版权归原作者所有,如侵犯权益,请联系删除)