十字型微通道制备粒径均一的纤维素层析介质

引言

微流芯片于20世纪90年代提出并逐步发展，利用合理设计的微通道，可实现流体的微调控，完成反应、分离和分析等过程。根据微通道形式的不同，分为H型、Y型、十字型、共流式、流体聚焦式和台阶式等。采用微流芯片制备粒径均一的微球已成为研究的新热点，所用材料包括海藻酸钙、壳聚糖/三聚磷酸钠、丙烯酰胺、明胶、乙基纤维素、水凝胶等，其中具有微流聚焦效应的十字型微通道使用最广泛。对于固定床层析过程，粒度均一的介质可提高分辨率，减少床层压降。鉴于微流芯片制备微球具有设备和操作简单，微球单分散性好，粒径可控等优势，可成为层析微球制备的新方法。

再生纤维素微球具有合适的多孔结构、刚性和机械强度，以及良好的化学反应特性，可作为生物大分子层析分离的良好基质材料。但是，由于纤维素分子内和分子间具有很强的氢键作用，使得纤维素无法溶于水和普通有机溶剂，加工难度大。近年来发现一些离子液体可直接溶解纤维素，浓度可高达5%以上，其优良性能已受到广泛关注，成为纤维素‘’绿色‘’加工的新方法。纤维素微球制备主要有喷射法和悬浮法两类。对于喷射法，由合适的喷嘴将纤维素或其衍生物的溶液喷射到惰性介质或空气中分散，制得微球的粒径比较均匀，但设备要求高。悬浮分散法将纤维素溶液分散悬浮于不相溶的惰性介质中，再生形成微球。由于液滴悬浮分散难以均一，微球的粒径分布比较宽，需要进一步筛分，以得到合适粒径的微球，目前常用多糖介质多采用悬浮分散法制备。以离子液体[BMIM]CI为溶剂，采用反相悬浮法，已成功制备了纤维素微球，但粒径分布较宽，主要用于扩张床吸附分离。

针对纤维素溶液黏度较高的特性，本文选用十字型微通道，采用离子液体1-乙基-3-甲基咪唑甲基磷酸[EMIM]MP直接溶解微晶纤维素，以纤维素溶液为水相，葵花籽油为油相，通过十字型微通道的聚焦分散作用，得到粒径均一的微液滴，固化成纤维素微球，进一步偶联DEAE配基作为离子交换介质，为研制新型纤维素层析介质打下基础。

1材料与方法

1.1主要材料

微晶纤维素，上海恒信化学试剂有限公司，聚合度为250左右；1-乙基-3-甲基咪唑甲基磷酸，[EMIM]MP，法国Solvionic公司；金龙鱼葵花籽油，丰益贸易有限公司；牛血清白蛋白（BSA），分子量67*10 3公司；盐酸2-氯三乙胺；DEAE SeoharoseFF；Span和无水乙醇，市售分析纯。

1.2纤维素微球制备

纤维素微球制备一般分为溶解、分散、固化、再生和后处理五个过程。由于多数离子液体溶解纤维素需要较高温度（80-90摄氏度），而有机材料制成的微流芯片在高温下容易变形，因此本文选用Fukaya等报道的离子液体[EMIM]MP，可在25摄氏度、5h溶解5%微晶纤维素（DP=250）。

纤维素微球的制备装置见图1。内有十字型微通道的微流芯片由台湾成功大学林裕诚教授惠赠，主要包括以聚甲基丙烯酸甲酯为材质的三层平板，中间层利用激光雕蚀形成十字型微通道，上层是水相和油相入口，下层是微液滴出口。在前期研究基础上，选择45摄氏度的恒温条件，以添加Span85的葵花籽油为油相，以合适浓度的纤维素-离子液体溶液为水相，通过十字型微通道将纤维素溶液剪切分散成粒径均一的微液滴，滴入水中，搅拌促使纤维素再生，实现纤维素微球的固化成形。最后，用去离子水浸泡冲洗纤维素微球，去除残余的离子液体。

图1微流芯片和纤维素微球制备示意图

1.3PHP离子交换介质的制备

DEAE配基偶联分为两步；先将纤维素微球浸入强碱中碱化，然后加入盐酸；:氯三乙胺，在适当温度下偶联形成阴离子交换介质。采用文献方法，称取2g抽干介质于25ml三角瓶中，加入4ml、5mol*L-1的盐酸2-氯三乙胺溶液，于60摄氏度恒温水浴摇床中预热10min，取4ml、6mol*L-1的NaOH加入锥形瓶中，150r*min-1摇床反应2h；反应结束后迅速冷却，用大量去离子水清洗，得到偶联DEAE的纤维素层析介质，保存于20%乙醇中备用。

1.4液滴和微球粒径分析

1.4.1微液滴直径

采用显微镜法，用带有标尺的光学显微镜,观察微液滴，利用Image-proplus 5.0软件随机分析150个液滴的直径，计算平均直径8和分布系数CV

式中di为液滴的直径，n为液滴数。

1.4.2微球粒径分布

微球粒径分布采用LS-230 Coulter激光粒径仪分析。

1.5微球表观形态

用浓度梯度逐步增大的乙醇溶液替换出微球中的水分，采用co2临界点干燥仪干燥，通过扫描电镜观察微球的表面形态。

1.6微球基本物性

微球的湿真密度。含水率、孔度、孔容等基本物性参照文献方法测定。

1.7离子交换容量

离子交换容量指单位质量介质中可交换的酸性或碱性基团的含量，本文采用AgNO3滴定法测定阴离子交换配基DEAE偶联量。先使DEAE配基与C1-充分结合，然后加入过量Na2SO4溶液，用SO4置换出C1-，最后滴定测定置换出的C1-，计算离子交换容量。

1.8静态吸附平衡

以BSA为模型吸附蛋白考察静态吸附平衡。将介质用缓冲液。(平衡+);G3；抽滤，称取约0.03g置于2ml离心管中，加入1ml不同浓度的BSA溶液；将离心管置于恒温混匀仪中，25摄氏度下1000r*min-1振荡3h；达到平衡后，取上清液280nm;测定BSA浓度。根据物料平衡计算吸附容量，本文以单位质量介质吸附[/B的质量来表示吸附容量。采用Langmuir吸附等温式，拟合得到其饱和吸附容量和解离常数。

式中Q为平衡吸附容量，mg*（g介质）；为吸附平衡后液相的蛋白浓度为

饱和吸附容量"; 为解离常数";

图2 2%纤维素制备微球的电镜分析照片

1.9吸附动力学

用缓冲液配制0.5mg*ml-1BSA溶液，取100ml置于三角瓶中，磁力搅拌器搅拌，由蠕动泵驱动，溶液经0.22um滤膜过滤，再经紫外检测仪，循环回到三角瓶。当紫外检测仪基线稳定后，将0.356g抽干介质加入到蛋白溶液中，紫外检测仪实时检测溶液中蛋白浓度的变化，绘制随时间变化的吸附动力学曲线。

2结果与讨论

2.1纤维素浓度的影响

纤维素浓度是纤维素微球制备的关键因素，不仅决定离子液体溶解纤维素的时间，还影响纤维素:离子液体溶液的黏度，从而影响微通道内的流型和微液滴的形成。随着纤维素浓度的增加，纤维素:离子液体溶液的黏度显著增加。实验发现，过高黏度的纤维素溶液不利于形成粒径均一的微液滴。此外，纤维素浓度过高将造成微球的孔隙率较低，影响生物大分子的吸附性能。

考察了5个纤维素浓度，以纤维素:离子液体溶液为水相，葵花籽油为油相，控制合适的油相和水相流速，可以形成微液滴，固化成纤维素微球。微球经清洗和干燥后，用扫描电镜观察表面形貌，结果见图；。比较发现；?纤维素浓度制备微球的球形度较好，具有典型的多孔结构，微球表面和内部孔道分布较均匀，与常用琼脂糖凝胶的结构十分相似，故后续研究选取2%纤维素浓度。

2.2分散剂的影响

选用Span85作为油相分散剂，考察不同Span85浓度对微液滴直径和粒径分布的影响，结果见图3。未添加Span85时，纤维素溶液分散不好，液滴形成不稳定，极易破裂；当Span85浓度较低，液滴大小不均匀，粒径分布较宽；当Span85浓度在,5%-7%之间，液滴较小，粒径分布较窄；随Span85浓度进一步增大，微液滴粒径和粒径分布都有所增大。选定Span85添加量为5%-6%。

图3 Span85添加量对微液滴粒径和,$值的影响

2.3油水两相流速的影响

调节合适的水相流速、油相流速以及油相)水相流速比是控制微液滴大小的有效手段。结合前期研究，固定4个油相流速和油相，考察了不同水相流速!P和油相)水相流速比对微液滴直径和粒径分布的影响，结果见图4。

图4油水两相流速对微液滴粒径和,$值的影响

从图中可以看出，油相流速相同时，随着水相流速增大，形成的液滴直径也逐渐增大；在不同的油相流速下，液滴直径增大的幅度不同，油相流速越小，液滴直径增大越快。水相流速相同时，随着油相流速增大，即增加油相)水相流速比，导致微液滴粒径的减小。当水相流速为5ul*min-1时，油相流速在200-400ul*min-1。(;G3>*范围内均可得到直径约100ul的液滴，但是油相)水相流速比过大，过程较难控制，且造成油相浪费。比较,$值发现，基本都在0.1-0.25之间，特别是油相流速为200ul*min-1时，CV值基本在0.15以下，微液滴粒径分布均一。

综合考虑微液滴直径、CV值、制备时间和成本等因素，选择油相流速200ul*min-1，水相流速6ul*min-1为最佳条件，可形成粒径100um左右、分布较均一的微液滴。图5为纤维素微液滴的显微镜照片，可见液滴直径分布比较均一。

图5 纤维素微液滴的显微镜照片

2.4纤维素微球的理化性质

采用2%纤维素溶液为水相，添加5%Span85的葵花籽油为油相，水相流速6ul*min-1，油相流速200ul*min-1的优化条件下，十字型微通道内形成微液滴，固化成球，得到粒径均一的纤维素微球。微球的基本性质见表1，并与商品化纤维素介质和常用琼脂糖介质进行比较。结果表明，本文制备纤维素微球的湿真密度比略小，含水率、孔度和孔容均较大。孔度较高与制备中纤维素浓度和聚合度较低有关，较大的孔道空间有利于生物大分子的传质分离。

纤维素微球的粒径分布如图6所示，体均粒径见表1。可以看出，本文制备微球的平均粒径与常用介质十分接近，均为100um左右。未经筛分的微球粒径分布与商用介质相似，分布对称性较好，体现出微通道制备粒径均一微球的优势。

2.5纤维素离子交换介质及其吸附性能

以纤维素微球为基质，偶联上阴离子交换基团DEAE，得到了DEAE阴离子交换介质，命名为Cell-MC-DEAE，测得离子交换容量为123.3umol*g-1。与课题组前期用反向悬浮法制得的纤维素微球介质相比较小，也低于常用的商业化介质DEA和DEAE见表2DEAE介质对[/B的吸附等温线如图7所示，并以Y43=;1G2等温式拟合吸附等温线。由图可见，式3可以很好地拟合实验数据，得到的饱合吸附容量!;和解离常数、N见表2。

表1不同!PHP离子交换介质的吸附性能比较

图6 纤维素微球和商用介质的粒径分布比较

Cell-MC-DEAE的饱合吸附容量为220mg*g-1，相比于施霏制备的介质，虽然离子交换容量较小，但吸附量较大。原因可能是施霏所用的纤维素溶液浓度高，而本文纤维素浓度仅为2%，形成纤维素微球的内部孔径较大，生物大分子的有效吸附表面较高。图7还比较了本文制备介质和商用介质DEAESwpharose FF、DEACell-lulineA-500的静态吸附平衡，可以看出DEACell-luline的吸附容量较大，大约是DEAESwpharose FF介质的两倍，略高于DEAE,6。。1QG36B:@))介质，体现出高吸附容量的特色。此外，,6。。:U,:DEAE的、N较小，即在低蛋白浓度下具有较高的吸附容量，有利于蛋白质的吸附分离。

DEAESwpharose FF介质对[/B的吸附动力学曲线如图C所示，并与DEAE/6JL42%E655和A.:B.,6。。1QG36B:@))介质比较。采用孔扩散模型拟合吸附动力学曲线，得到孔扩散系数，J和有效扩散系数，6见表；。比较发现，虽然,6。。:U,:A.:B.介质的离子交换容量略低于DEAE/6JL42%E655，但有效扩散系数是DEAE/6JL42%E655的；倍以上；,6。。:U,:DEAE的孔扩散系数与,6。。1QG36B:@))相当。结果表明，本文制备纤维素介质具有较大孔径，有利于生物大分子的孔内传质和吸附分离。

图7 BSA吸附等温线及与常用介质比较

图8不同介质的[/B吸附动力学比较

3结论

以离子液体[EMIM]MP直接溶解纤维素作为水相，在45摄氏度恒温条件下，以十字型微通道对纤维素溶液进行分散，得到粒径均一的纤维素微液滴，固化再生，得到纤维素微球。确定了合适的制备条件%纤维素浓度为2%，油相添加5%Span85油、水两相流速分别为200ul*min-1和6ul*min-1，制得微球球形度好，粒径较均一，且具有较高孔度和孔容。微球偶联DEAE配基，制得离子交换层析介质，离子交换容量为123.3umol*g-1，饱和吸附容量Qm达220mg*g-1，有效扩散系数De为1.8*10-11m2*s-1，体现出良好的层析分离应用前景。

文献来源化工学报DOI：10.3969/j.issn.0438-1157.2013.02.036作者：童芳丽，林东强，刘川，贺军贤，姚善泾

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