十字型微通道制备粒径均一的纤维素层析介质-汶颢股份
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十字型微通道制备粒径均一的纤维素层析介质

引言

微流芯片20世纪90年代提出并逐步发展利用合理设计的微通道可实现流体的微调控完成反应分离和分析等过程根据微通道形式的不同分为H型Y十字型共流式流体聚焦式和台阶式等采用微流芯片制备粒径均一的微球已成为研究的新热点所用材料包括海藻酸钙壳聚糖/三聚磷酸钠丙烯酰胺明胶乙基纤维素水凝胶等其中具有微流聚焦效应的字型微通道使用最广泛对于固定床层析过程粒度均一的介质可提高分辨率减少床层压降鉴于微流芯片制备微球具有设备和操作简单微球单分散性好粒径可控等优势可成为层析微球制备的新方法

再生纤维素微球具有合适的多孔结构刚性和机械强度以及良好的化学反应特性可作为生物大分子层析分离的良好基质材料但是由于纤维素分子内和分子间具有很强的氢键作用使得纤维素无法溶于水和普通有机溶剂加工难度大近年来发现一些离子液体可直接溶解纤维素浓度可高达5%以上其优良性能已受到广泛关注成为纤维素‘’绿色‘’加工的新方法纤维素微球制备主要有喷射法和悬浮法两类对于喷射法由合适的喷嘴将纤维素或其衍生物的溶液喷射到惰性介质或空气中分散制得微球的粒径比较均匀但设备要求高悬浮分散法将纤维素溶液分散悬浮于不相溶的惰性介质中再生形成微球由于液滴悬浮分散难以均一微球的粒径分布比较宽需要进一步筛分以得到合适粒径的微球目前常用多糖介质多采用悬浮分散法制备以离子液[BMIM]CI为溶剂采用反相悬浮法已成功制备了纤维素微球但粒径分布较宽主要用于扩张床吸附分离

针对纤维素溶液黏度较高的特性本文选用十字型微通道采用离子液体1-乙基-3-甲基咪唑甲基磷酸[EMIM]MP直接溶解微晶纤维素以纤维素溶液为水相葵花籽油为油相通过十字型微通道的聚焦分散作用得到粒径均一的微液滴固化成纤维素微球进一步偶联DEAE配基作为离子交换介质为研制新型纤维素层析介质打下基础

1材料与方法

1.1主要材料

微晶纤维素上海恒信化学试剂有限公司聚合度为250左右1-乙基-3-甲基咪唑甲基磷酸[EMIM]MP法国Solvionic公司金龙鱼葵花籽油丰益贸易有限公司牛血清白蛋白BSA),分子量67*10 3公司盐酸2-氯三乙胺DEAE SeoharoseFFSpan和无水乙醇市售分析纯

1.2纤维素微球制备

纤维素微球制备一般分为溶解分散固化再生和后处理五个过程由于多数离子液体溶解纤维素需要较高温度80-90摄氏度),而有机材料制成的微流芯片在高温下容易变形因此本文选用Fukaya等报道的离子液体[EMIM]MP,可在25摄氏度、5h溶解5%微晶纤维素DP=250)。

纤维素微球的制备装置见图1内有十字型微通道的微流芯片由台湾成功大学林裕诚教授惠赠主要包括以聚甲基丙烯酸甲酯为材质的三层平板中间层利用激光雕蚀形成十字型微通道上层是水相和油相入口下层是微液滴出口在前期研究基础上选择45摄氏度的恒温条件以添加Span85的葵花籽油为油相以合适浓度的纤维素-离子液体溶液为水相通过十字型微通道将纤维素溶液剪切分散成粒径均一的微液滴滴入水中搅拌促使纤维素再生实现纤维素微球的固化成形最后用去离子水浸泡冲洗纤维素微球去除残余的离子液体

微流芯片和纤维素微球制备示意图 

1微流芯片和纤维素微球制备示意图

1.3PHP离子交换介质的制备

DEAE配基偶联分为两步先将纤维素微球浸入强碱中碱化然后加入盐酸:氯三乙胺在适当温度下偶联形成阴离子交换介质采用文献方法称取2g抽干介质于25ml三角瓶中加入4ml、5mol*L-1的盐酸2-氯三乙胺溶液60摄氏度恒温水浴摇床中预热10min,4ml、6mol*L-1NaOH加入锥形瓶中150r*min-1摇床反应2h反应结束后迅速冷却用大量去离子水清洗得到偶联DEAE的纤维素层析介质保存于20%乙醇中备用

1.4液滴和微球粒径分析

1.4.1微液滴直径

采用显微镜法用带有标尺的光学显微镜,观察微液滴利用Image-proplus 5.0软件随机分析150个液滴的直径计算平均直径8和分布系数CV

平均直径8和分布系数CV 

式中di为液滴的直径n为液滴数

1.4.2微球粒径分布

微球粒径分布采用LS-230 Coulter激光粒径仪分析

1.5微球表观形态

用浓度梯度逐步增大的乙醇溶液替换出微球中的水分采用co2临界点干燥仪干燥通过扫描电镜观察微球的表面形态

1.6微球基本物性

微球的湿真密度含水率孔度孔容等基本物性参照文献方法测定

1.7离子交换容量

离子交换容量指单位质量介质中可交换的酸性或碱性基团的含量本文采用AgNO3滴定法测定阴离子交换配基DEAE偶联量先使DEAE配基与C1-充分结合然后加入过量Na2SO4溶液SO4置换出C1-,最后滴定测定置换出的C1-,计算离子交换容量

1.8静态吸附平衡

BSA为模型吸附蛋白考察静态吸附平衡将介质用缓冲液(平衡+);G3抽滤称取约0.03g置于2ml离心管中加入1ml不同浓度的BSA溶液将离心管置于恒温混匀仪中25摄氏度1000r*min-1振荡3h达到平衡后取上清液280nm;测定BSA浓度根据物料平衡计算吸附容量本文以单位质量介质吸附[/B的质量来表示吸附容量采用Langmuir吸附等温式拟合得到其饱和吸附容量和解离常数

拟合得到其饱和吸附容量和解离常数 

式中Q为平衡吸附容量mg*(g介质);为吸附平衡后液相的蛋白浓度为

饱和吸附容量"; 为解离常数";

2%纤维素制备微球的电镜分析照片 

2 2%纤维素制备微球的电镜分析照片

1.9吸附动力学

用缓冲液配制0.5mg*ml-1BSA溶液100ml置于三角瓶中磁力搅拌器搅拌由蠕动驱动溶液经0.22um滤膜过滤再经紫外检测仪循环回到三角瓶当紫外检测仪基线稳定后0.356g抽干介质加入到蛋白溶液中紫外检测仪实时检测溶液中蛋白浓度的变化绘制随时间变化的吸附动力学曲线

2结果与讨论

2.1纤维素浓度的影响

纤维素浓度是纤维素微球制备的关键因素不仅决定离子液体溶解纤维素的时间还影响纤维素:离子液体溶液的黏度从而影响微通道内的流型和微液滴的形成随着纤维素浓度的增加纤维素:离子液体溶液的黏度显著增加实验发现过高黏度的纤维素溶液不利于形成粒径均一的微液滴此外纤维素浓度过高将造成微球的孔隙率较低影响生物大分子的吸附性能

考察了5个纤维素浓度以纤维素:离子液体溶液为水相葵花籽油为油相控制合适的油相和水相流速可以形成微液滴固化成纤维素微球微球经清洗和干燥后用扫描电镜观察表面形貌结果见图;。比较发现?纤维素浓度制备微球的球形度较好具有典型的多孔结构微球表面和内部孔道分布较均匀与常用琼脂糖凝胶的结构十分相似故后续研究选取2%纤维素浓度

2.2分散剂的影响

选用Span85作为油相分散剂考察不同Span85浓度对微液滴直径和粒径分布的影响结果见图3未添加Span85纤维素溶液分散不好液滴形成不稳定极易破裂Span85浓度较低液滴大小不均匀粒径分布较宽Span85浓度在,5%-7%之间液滴较小粒径分布较窄Span85浓度进一步增大微液滴粒径和粒径分布都有所增大选定Span85添加量为5%-6%

 Span85添加量对微液滴粒径和,$值的影响 

3 Span85添加量对微液滴粒径和,$值的影响

2.3油水两相流速的影响

调节合适的水相流速油相流速以及油相)水相流速比是控制微液滴大小的有效手段结合前期研究固定4个油相流速和油相,考察了不同水相流速!P和油相)水相流速比对微液滴直径和粒径分布的影响结果见图4

油水两相流速对微液滴粒径和,$值的影响 

4油水两相流速对微液滴粒径和,$值的影响

从图中可以看出油相流速相同时随着水相流速增大形成的液滴直径也逐渐增大在不同的油相流速下液滴直径增大的幅度不同油相流速越小液滴直径增大越快水相流速相同时随着油相流速增大即增加油相)水相流速比导致微液滴粒径的减小当水相流速为5ul*min-1油相流速在200-400ul*min-1(;G3>*范围内均可得到直径约100ul的液滴但是油相)水相流速比过大过程较难控制且造成油相浪费比较,$值发现基本都在0.1-0.25之间特别是油相流速为200ul*min-1CV值基本在0.15以下微液滴粒径分布均一

综合考虑微液滴直径CV制备时间和成本等因素选择油相流速200ul*min-1水相流速6ul*min-1为最佳条件可形成粒径100um左右分布较均一的微液滴5为纤维素微液滴的显微镜照片可见液滴直径分布比较均一

纤维素微液滴的显微镜照片 

5 纤维素微液滴的显微镜照片

2.4纤维素微球的理化性质

采用2%纤维素溶液为水相添加5%Span85的葵花籽油为油相水相流速6ul*min-1油相流速200ul*min-1的优化条件下十字型微通道内形成微液滴固化成球得到粒径均一的纤维素微球微球的基本性质见表1并与商品化纤维素介质和常用琼脂糖介质进行比较结果表明本文制备纤维素微球的湿真密度比略小含水率孔度和孔容均较大孔度较高与制备中纤维素浓度和聚合度较低有关较大的孔道空间有利于生物大分子的传质分离

纤维素微球的粒径分布如图6所示体均粒径见表1可以看出本文制备微球的平均粒径与常用介质十分接近均为100um左右未经筛分的微球粒径分布与商用介质相似分布对称性较好体现出微通道制备粒径均一微球的优势

2.5纤维素离子交换介质及其吸附性能

以纤维素微球为基质偶联上阴离子交换基团DEAE,得到了DEAE阴离子交换介质命名为Cell-MC-DEAE,测得离子交换容量为123.3umol*g-1。与课题组前期用反向悬浮法制得的纤维素微球介质相比较小也低于常用的商业化介质DEADEAE见表2DEAE介质对[/B的吸附等温线如图7所示并以Y43=;1G2等温式拟合吸附等温线由图可见3可以很好地拟合实验数据得到的饱合吸附容量!;和解离常数N见表2

1不同!PHP离子交换介质的吸附性能比较

不同!PHP离子交换介质的吸附性能比较

纤维素微球和商用介质的粒径分布比较 

6 纤维素微球和商用介质的粒径分布比较

Cell-MC-DEAE的饱合吸附容量为220mg*g-1,相比于施霏制备的介质虽然离子交换容量较小但吸附量较大原因可能是施霏所用的纤维素溶液浓度高而本文纤维素浓度仅为2%形成纤维素微球的内部孔径较大生物大分子的有效吸附表面较高7还比较了本文制备介质和商用介质DEAESwpharose FF、DEACell-lulineA-500的静态吸附平衡可以看出DEACell-luline的吸附容量较大大约是DEAESwpharose FF介质的两倍略高于DEAE,6。。1QG36B:@))介质体现出高吸附容量的特色此外,6。。:U,:DEAEN较小即在低蛋白浓度下具有较高的吸附容量有利于蛋白质的吸附分离

DEAESwpharose FF介质对[/B的吸附动力学曲线如图C所示并与DEAE/6JL42%E655和A.:B.,6。。1QG36B:@))介质比较采用孔扩散模型拟合吸附动力学曲线得到孔扩散系数J和有效扩散系数6见表;。比较发现虽然,6。。:U,:A.:B.介质的离子交换容量略低于DEAE/6JL42%E655但有效扩散系数是DEAE/6JL42%E655的倍以上,6。。:U,:DEAE的孔扩散系数与,6。。1QG36B:@))相当结果表明本文制备纤维素介质具有较大孔径有利于生物大分子的孔内传质和吸附分离

BSA吸附等温线及与常用介质比较 

7 BSA吸附等温线及与常用介质比较

不同介质的[/B吸附动力学比较 

8不同介质的[/B吸附动力学比较

3结论

以离子液体[EMIM]MP直接溶解纤维素作为水相45摄氏度恒温条件下以十字型微通道对纤维素溶液进行分散得到粒径均一的纤维素微液滴固化再生得到纤维素微球确定了合适的制备条件%纤维素浓度为2%,油相添加5%Span85水两相流速分别为200ul*min-1和6ul*min-1,制得微球球形度好粒径较均一且具有较高孔度和孔容微球偶联DEAE配基制得离子交换层析介质离子交换容量为123.3umol*g-1,饱和吸附容量Qm220mg*g-1,有效扩散系数De1.8*10-11m2*s-1,体现出良好的层析分离应用前景

文献来源化工学报DOI:10.3969/j.issn.0438-1157.2013.02.036作者:童芳丽,林东强,刘川,贺军贤,姚善泾

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