微滴式数字PCR——原理与介绍-汶颢股份
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微滴式数字PCR——原理与介绍

自从1985年美国科学家Kary Mullis发明PCR方法以来,该方法已经成为生命科学研究领域中最常规的实验方法之一。PCR方法就是在体外采用DNA聚合酶促反应来特异性合成特定核酸片段达到富集的目的。PCR扩增产物可用于下游多种应用,如克隆表达、芯片杂交、突变检测、测序等等。
  “三代PCR的发展”PCR技术诞生至今,PCR技术已经经过了三代更迭。区分这三代的,主要是指PCR产物的检测方式。

第一代PCR

第一代PCR采用电泳的方式对PCR产物进行分析,主要的分析内容有:条带大小、条带数量、条带浓度等。根据电泳条带的这些信息能够实现研究者的某些实验目的,比如制备DNA片段、检测目的序列、对目的基因表达进行定性分析等。第一代PCR的最大缺陷在于无法实现精确定量。一句话概括第一代PCR:看PCR产物的电泳条带。

看PCR产物的电泳条带 

第二代PCR

第二代PCR即荧光定量PCR,它通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测荧光的积累,借助荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。但依赖于Cq值仍然是目前定量PCR最大的技术瓶颈,只有在规范的实验流程、统一的设计思路下,得到的结果才具有可重复性和可比性。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下,其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。一句话概括第二代PCR:检测反应体系中荧光的实时变化

检测反应体系中荧光的实时变化 

第三代PCR

由于荧光定量PCR在定量方面的缺陷,第三代PCR即数字PCR应运而生,它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标,即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。实现这一过程的关键在于采用某种分散手段,使一个完整的PCR体系分散成为成千上万个独立的PCR体系,每个PCR体系中只包含一个或零个模板(实际每个微体系中的模板数符合泊松分布)。这样,分别检测这些体系是否发生了PCR反应并且进行计数,便可进行精确定量。一个词概括数字PCR的检测方式:

数数 

数字PCR的计量方式——化一为万

核酸样品的分散是数字PCR中的第一步,也是最核心的步骤。从最早期的96或384孔,到如今已经将反应体系缩小至纳升或皮升级别。

理想情况下,DNA模板应该完全分散在不同的独立反应体系内(如微孔或微滴内)。这些微小的反应体系互不干扰,仪器通过检测每个微体系中的荧光变化来判断里面是否有PCR反应发生,若发生,即证明体系中有模板。

目前主流的样本分散方式有两种:以Thermo QuantStudio™ 3D数字PCR系统为代表的微流控芯片法、以及以BIO-RAD QX200™数字PCR系统为代表的微滴法。

1微流控芯片——硅板蚀刻“小房间”

QuantStudio™ 3D采用了高密度的纳升流控芯片技术,芯片中有多达20,000个反应孔,样品加样之后,会均匀分布到这些孔中,达到相互隔离的目的,PCR反应之后,计数器会读取每个微孔中得到荧光信号并计数。

硅板蚀刻“小房间” 

2微滴法——油包水“小房间”

BIO-RAD QX200™统结合了油包水乳化微滴技术与微流体技术,借助微滴发生器,可将每个样品生成20000 个均一的纳升级微滴,目的片段和背景序列在微滴中随机分布,每个微滴都是一个独立的反应器。在使用热循环仪进行 PCR 后,QX200 微滴分析仪将逐个分析每个样品中的液滴。微滴被吸入后,管路将分解乳化的液滴,并使它们依次通过一个双色光学检测系统。系统将计算阳性和阴性微滴的数量,从而以数字格式对靶 DNA 进行绝对定量分析。

 油包水“小房间” 

BIO-RAD QX200™数字PCR系统为例,详细讲解数字PCR的操作步骤和应用举例。

微滴式数字PCR——简易操作流程

BIORAD QX200微滴式数字PCR为例,为大家讲解操作流程

微滴式数字PCR 

从流程图中可以看出,QX200 ddPCR的简易操作流程包括以下几个步骤:

QX200 ddPCR的简易操作流程 

1制备ddPCR反应液

选用适宜的探针法预混液,振荡混匀,离心除气泡,注意所加样本核酸含量不要超过规定检测范围(1~100000拷贝片段化核酸或者1~20000拷贝完整基因组DNA,如完整的人类基因组DNA不要超过66ng/20ul),提前用限制性内切酶处理样本可提高检测浓度。另外,用质粒作为模板时建议酶切以消除复杂结构,做CNV实验时必须对DNA模板进行高频酶切;这样做的目的是降低模板的粘稠度,更有利于模板的分散和微滴的形成。

2制备微滴

安装

8孔微滴生成板打开包装,安装到支架上,注意微滴生成板的方向与支架上标记方向一致。

 

将8孔微滴生成板打开包装,安装到支架上,注意微滴生成板的方向与支架上标记方向一致 

加样

20ul样品反应体系加入到微滴生成板中间一排的8个孔内,不足8个样品时用稀释一倍的20ul 1×buffer control 补足,不能留空。在微滴生成板最底下一排 8 个孔中各加入 70ul 微滴生成油(DG Oil,探针法与染料法用不同的生成油),同样不能留空。

加样 

微滴生成

盖上胶垫,注意两边的小孔都要钩牢;将其轻轻地平稳放置于微滴生成仪中,开始生成微滴,注意仪器上指示灯状态,一般约2分钟即可完成。完成之后,微滴生成于板的最上面一排孔内:

 

微滴生产 

3进行PCR扩增

使用移液器,小心地从微滴生成板中吸取40μl,缓慢转移至96孔PCR板中。由于数字PCR检测的是每个液滴中最终是否含有荧光,从而判定微滴中是否含有模板,而不是实时观测每个液滴或每管中荧光变化的循环数,因此,使用常规的热循环仪即可进行数字PCR扩增。扩增的参数根据引物和模板决定,不再赘述。

PCR扩增 

4读取并分析结果

结果读取

PCR扩增结束之后,每一孔中将有不同数量的微滴产生了荧光信号,接下来就需要读取这些微滴,将每孔的微滴总数及含有荧光的微滴数统计出来。

将之前完成PCR的96孔板放入底座中组装好,盖好顶部支架,之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中,如图:

结果读取 

微滴读取仪将依次吸取每孔中的微滴,依次让微滴流过检测器进行荧光检测,并对每一个微滴的相对荧光值进行记录。

微滴的相对荧光值进行记录 

数据分析

设定RFU的阈值之后,通过之前讲述过的泊松分布,程序将自动计算出该体系中的模板浓度(copies/μl)。

数据分析 

当检测SNV基因型时,反应体系中有两条探针(如FAM-BHQ水解探针和VIC-BHQ水解探针),程序将根据您设定的阈值绘制二维聚类图,从而计算出每个象限中的模板个数:

象限中的模板 

通过计算三个象限中微滴个数占总数量的比例,即可方便地计算出模板中野生纯合子、突变纯合子以及杂合子所占的比值。

当然,除了检测SNV,数字PCR还有很多广泛的用途:

数字PCR——优缺点与应用

数字PCR的优势

得益于日益完善的“有限稀释”技术,使得数字PCR在分析模板含量及组成方面有着无可比拟的灵敏度。相对于上一代qPCR,dPCR的优势体现在以下几个方面:

高检测灵敏度

传统的常规PCR以及荧光定量qPCR,分别通过电泳条带染色以及扩增循环过程中荧光的增加来检测模板DNA的含量,这两种检测方法决定了低拷贝数的模板难以检测到。而数字PCR将一个传统的PCR反应分割成了数万个体系,这些体系独立扩增,独立检测,保证了个位数的模板数量都可以被检测到。

高定量精确度

使用qPCR进行绝对定量,需要制备反应标准品,绘制标准曲线,根据待检样品和标准曲线的关系进行换算,在反应和换算过程中势必会引入极大误差。而dPCR抛弃了标准品,通过微体系的荧光计数,直接将反应初始模板数量统计出来,即使某些微滴中的模板数量不止一个,也可以通过引入泊松分布提升其计算精确度。

高耐受性

当反应体系中有PCR抑制物存在时,常规的PCR体系经常会受到影响。而dPCR第一步反应体系的分配过程中,会导致模板和抑制物分配到不同的体系,从而显著降低了抑制物的干扰。并且,与qPCR不同的是,dPCR检测的是终点荧光,即使微体系稍微受到了影响,也不会影响最终结果的判读。

数字PCR的不足

1.模板添加量要求较高

正是由于数字PCR将反应拆分成了数万个独立体系,因此其对模板量有比较高的要求,如果模板量饱和,超过了微体系的数量,那么每个微滴都将有信号,无法进行定量;反之,如果模板量太少,仅有几个微滴产生荧光信号,势必也降低了定量的准确性。因此,进行dPCR之前,需要摸索模板的添加量,将模板稀释到合适的浓度,如同qPCR预实验需进行梯度稀释找到合适的Cq值时的模板浓度一样。

2.非特异性产物的判断

不同于常规PCR和qPCR,可以分别通过电泳条带和熔解曲线观测特异性,数字PCR观测的是每个体系中的终点荧光,无论PCR产物是否是特异性产物,只要荧光信号足够强,也是会判读为阳性结果。因此dPCR的引物特异性要求极高,并且十分推荐采用特异性高的探针法而非染料法进行实验。

针对上述两个问题,通常进行dPCR之前,需要先进行qPCR,根据Cq值来确定模板的稀释倍数,并通过熔解曲线进行扩增特异性的判断。

数字PCR的应用

痕量核酸检测

dPCR尤其适合对灵敏度要求非常高的核酸痕量分析研究,如环境水样的微生物检测等。在癌症低频突变检测方面,在一份给定的样本中,相比于野生型DNA,癌症相关的突变序列比例较低,经常无法检测。而凭借其超高灵敏度,dPCR系统可以很容易地定量分析低至0.001%-0.0001%的突变频率。突破了其他方法的局限性。使用数字PCR技术,研究人员现在能够实现对突变位点更细微的定量分析,更好地明确其在癌症中的相关作用。

BRAF是人类最重要的原癌基因之一,大约8%的人类肿瘤发生BRAF突变。BRAF的绝大部分突变形式为BRAF V600E突变, 主要发生于黑色素瘤、结肠癌和甲状腺癌中。该突变导致下游MEK-ERK信号通路持续激活,对肿瘤的生长增殖和侵袭转移至关重要, 是抗黑色素瘤等V600E突变肿瘤的有效作用靶标之一。dPCR系统的高灵敏度可以确保对野生型DNA背景下的BRAF V600E突变进行精确的定量分析。

洞察病毒载量

精确的病毒载量分析对于阐释疾病病程,后续治疗及疗效评估是至关重要的。病毒载量的波动,即使只下降了非常低的水平,意义却是显著的。在对病原体的研究中,能否实现准确而可靠的病毒DNA或RNA定量分析,关系到实验的成败。

病毒DNA或RNA定量 

研究人员比较了qPCR和dPCR方法检测临床样本中残留的人类免疫缺陷病毒(HIV),其中包括功能性治愈的HIV感染婴儿。研究人员发现,在检测百万个细胞内的HIV DNA拷贝数时,相比于qPCR,dPCR的灵敏度提升了5倍;在检测病毒长末端重复序列时,dPCR比qPCR灵敏提升了20倍。

区分基因组变异

在人类基因组中,拷贝数变异(CNV)是个体差异的一个重要来源。CNV与癌症,神经系统和自身免疫性疾病,药物不良反应有密切的关系。可靠地识别这类CNVs是开创性研究的一项重要手段。

拷贝数(CN)评估的主要技术瓶颈是如何在统计置信度下有效区分连续的CN。从根本上说,随着CN增加,目标遗传物质之间的差异百分比下降,这使得CNV的检测更加困难。dPCR系统通过在成千上万个微滴中进行CNV特定片段的扩增反应,实现在卓越的统计置信度下,对更高连续拷贝数(例如5拷贝和6拷贝)的区分。

连续拷贝数(例如5拷贝和6拷贝)的区分 

Bharuthram等按照标准方法分别使用qPCR和dPCR对CCL4L基因拷贝数进行评估测定。研究表明,与qPCR(r=0.87,P<0.0001)相比,由dPCR测得CCL4L拷贝与CCL4L1和CCL4L2拷贝之和具有良好的相关性(r=0.99,P<0.0001)。而qPCR在高拷贝数时出现准确性明显下降。

NGS验证及文库定量

dPCR平台可以方便地与下一代测序(NGS)文库制备流程对接,精确定量测序文库。 除了精确量化,QX200 系统所得到的结果包含测序文库的定性信息,这是当前其他方法所不具备的。这确保了文库上样量的一致性,提高NGS的使用效率与成功率。NGS运行结束后,dPCR还能对NGS的结果进行验证,诸如单核苷酸多态性,突变及拷贝数变异在内的基因组变异。

NGS验证及文库定量 

图表显示dPCR与MiSeq实验结果的比较。对于上样量100ng总RNA的低丰度转录子(TBP和GUSB基因),ddPCR检测的拷贝数为几千个copies/孔,这表明dPCR提高了检测灵敏度。而MiSeq测序在每千碱基每百万读长(RPKM)中只检测到个位数的记录。相比于RNA测序,ddPCR在扩增过程无偏差,且灵敏度提高了1000倍以上。

凭借简便、可靠的特点,数字PCR已经在癌症分子标志物的发现,传染病研究,基因组结构变异分析,基因表达分析等领域展现出了强大的优势。但这仅仅是一个开始,随着数字PCR的日益完善和改进,该技术将广泛应用于医疗检测、食品、环境农林领域的各个方面。

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