微滴式数字PCR——原理与介绍-汶颢股份
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微滴式数字PCR——原理与介绍

自从1985年美国科学家Kary Mullis发明PCR方法以来,该方法已经成为生命科学研究领域中最常规的实验方法之一。PCR方法就是在体外采用DNA聚合酶促反应来特异性合成特定核酸片段达到富集的目的。PCR扩增产物可用于下游多种应用,如克隆表达、芯片杂交、突变检测、测序等等。
  “三代PCR的发展”PCR技术诞生至今,PCR技术已经经过了三代更迭。区分这三代的,主要是指PCR产物的检测方式。

第一代PCR

第一代PCR采用电泳的方式对PCR产物进行分析,主要的分析内容有:条带大小、条带数量、条带浓度等。根据电泳条带的这些信息能够实现研究者的某些实验目的,比如制备DNA片段、检测目的序列、对目的基因表达进行定性分析等。第一代PCR的最大缺陷在于无法实现精确定量。一句话概括第一代PCR:看PCR产物的电泳条带。

看PCR产物的电泳条带 

第二代PCR

第二代PCR即荧光定量PCR,它通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测荧光的积累,借助荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。但依赖于Cq值仍然是目前定量PCR最大的技术瓶颈,只有在规范的实验流程、统一的设计思路下,得到的结果才具有可重复性和可比性。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下,其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。一句话概括第二代PCR:检测反应体系中荧光的实时变化

检测反应体系中荧光的实时变化 

第三代PCR

由于荧光定量PCR在定量方面的缺陷,第三代PCR即数字PCR应运而生,它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标,即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。实现这一过程的关键在于采用某种分散手段,使一个完整的PCR体系分散成为成千上万个独立的PCR体系,每个PCR体系中只包含一个或零个模板(实际每个微体系中的模板数符合泊松分布)。这样,分别检测这些体系是否发生了PCR反应并且进行计数,便可进行精确定量。一个词概括数字PCR的检测方式:

数数 

数字PCR的计量方式——化一为万

核酸样品的分散