绝对精准定量的数字PCR - 汶颢股份
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绝对精准定量的数字PCR

1985年Kary Mullis发明PCR技术以来,PCR及时一直生物医学领域中重要的实验方法。随着分子生物学技术的发展,荧光定量PCR是目前的主要核酸定量方法。数字PCR(digital PCR, dPCR)是近年来发展起来的新技术,由于其不需要建立标准曲线,可以对核酸的拷贝数进行绝对定量,因此具有更广泛的应用前景。

数字PCR技术的原理

数字PCR(digital PCR, dPCR)的原理并不复杂,dPCR是一种对含有核酸分子的标准反应体系进行有限稀释,使稀释后的每个反应含或不含一个或者多个拷贝的待检靶分子(DNA模板),实现每个反应为一个独立的PCR反应器,经PCR扩增后对每个独立反应进行检测,并以终点信号的有或无作为判断标准(有荧光信号的微滴判读为“1”,无荧光信号的微滴判读为“0”)。最后,根据泊松分布原理及阳性反应器的比例,利用分析软件计算待检靶分子的浓度或拷贝数,从而获得最终结果。

 

dPCR的特点是灵敏高、定量精确、检测的线性范围宽、特异性好、费用适中,是一种很有前途的分子定量检测手段。dPCR与传统PCR、定量PCR相比,定量结果不再依赖于Ct 值,直接给出靶序列的起始浓度,实现真正意义上的绝对定量,因此这项技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面的应用优势已被普遍认可,而其在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、NGS测序文库精确定量和结果验证等诸多方面具有的广阔应用前景已经受到越来越多的关注。

dPCR基本原理(微滴式)

dPCR基本原理(微滴式)

数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数,因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测;此外,由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态,因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点,完全不依赖于Ct值的鉴定,因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低,对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高;数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度,因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。

数字PCR的产生和发展

20 世纪末,Vogelstein 等在检测粪便中进行癌变组织脱离细胞的BRAF特异突变型基因时,因受到体细胞基因的干扰,而碰到检测灵敏度和检测分辨率的瓶颈,而采用了在384孔板中对每个反应孔的样品量进行极限稀释并增加反应孔数进行检测的方式,从而提出了数字式PCR的概念,同时也提出如果采用更多孔板其检测灵敏度会更高,从而指出了数字PCR系统的发展方向。

 

虽然dPCR技术的原理并不复杂,然而早期在第一步的样品稀释的环节上却遇到了相当大的困难,在稀释的数量和均匀性上都很难达到要求,这一困难极大地限制了dPCR技术的发展。直到近几年,dPCR技术终于突破了技术瓶颈,实现了商业化产品,目前主流核酸样品稀释分散技术主要包括基于微孔板,油包水微滴,微流控芯片等。

基于微孔芯片的数字 PCR 检测

基于微孔芯片的数字 PCR 检测

数字PCR技术的应用领域

1. 稀有变异检测

从外周血内获得分子生物标记物、进行特异突变筛查、监测病程是医疗保健的一个发展方向。这要求检测体系(探针和引物)必须保证能在高背景野生型等位基因存在的条件下检测到低丰度的突变基因。由于数字PCR降低了对反应扩增效率的要求,采取终点法判读的方法,数字PCR可以很好的胜任稀有变异检测的工作,同时也减少了引物设计过程中由于扩增效率不合要求而造成的浪费(时间、样品、耗材等等)。 

 

2. 拷贝数变异

虽然生殖系或体细胞拷贝数变化是否具有临床意义需要取决于具体临床情况,但CNV改变基因表达水平却有十分重要的临床意义。数字PCR具有准确性和精确性的特点,这使得其可以在CNV研究中发挥重要的作用。在有已知拷贝数的内参基因的前提下,数字PCR不但可以清晰区分一个或者两个拷贝,更可以对多拷贝基因进行分析,例如,五个或者六个拷贝。在这一点上,相比于包括qPCR在内的常规方法,数字PCR优势明显。 

 

3. 样本需求量低

数字PCR的一个主要优势是所需样本量很低,这对于一些临床样本来说特别重要,尤其是样本珍贵或者样本核酸存在降解的情况下。目前很多基因组研究方法,例如CGH芯片、二代测序等,在实验之前都需要对有限的临床样本进行扩增以保证达到实验样本量的要求。然而,实际情况是,预扩增会引入偏向,无法保证不改变样本内待测基因的相对丰度,对实验结果影响的严重程度取决于不同的应用。 数字PCR样本需求量低的特性可以避免由于预扩增所引入的实验误差,更好的实现实验的精准性和可靠性。 

 

4. 分析便捷

数字PCR有或无的结果判读非常简洁。对于相对定量分析来说,只需使用泊松原理将阴性/阳性微滴的比例转换成表达丰度、使用一个或多个内参基因进行均一化后即可完成分析。  

 

5. 与二代测序整合

如何在临床领域发挥NGS的巨大优势是一个重要的问题。数字PCR是一项非常有用的互补型技术。例如:使用数字PCR检测患者特异性标记物,与肿瘤配对末端测序实验结果进行相互验证,并且可以进行NGS文库的制备和定量。 

 

数字PCR为分子生物学、微生物学、液体活检等领域提供了新的检测方法和实验思路。从应用范围和实验成本角度来看,数字PCR不可能完全取代荧光定量PCR,但从重复性、准确性和样本量方面可以给PCR技术带来重要的补充。

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