毛红菊利用磁珠和微柱阵列芯片进行低成本定量检测核酸-汶颢股份
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毛红菊利用磁珠和微柱阵列芯片进行低成本定量检测核酸

作者:肖星凝

常用的PCR检测方法有琼脂糖凝胶电泳和实时定量PCR (qPCR)。琼脂糖凝胶电泳是一种简单、成本低廉的方法,结果直观,但只能说明产品的存在性和纯度。qPCR是一种半定量检测核酸的方法,已广泛应用于实验室和医院。然而,qPCR对DNA浓度的绝对定量需要一系列标准的扩增曲线,增加了整个实验的成本和复杂度。此外,当PCR扩增在体反应中进行时,定量罕见的靶标是困难的,在体反应中,大量的非靶标序列与靶标竞争PCR引物。因此,qPCR在检测循环肿瘤DNA和罕见突变DNA等方面存在不足。

新兴的高灵敏度数字PCR(dPCR)技术具有绝对准确的定量分析优势,是一项很有发展前途的技术。在该技术中,DNA样品被稀释并分割成大量的平行小室,大部分的共组分要么含有单个目标DNA,要么不含有目标DNA,从而可以对单个目标DNA进行扩增并分别检测到。定量的“是或否”终点信号被用来对阳性和阴性的区隔进行评分,因此通过对阳性区隔的计数,dPCR可以确定一个复杂种群中存在的初始DNA靶点的总数。现有的dPCR技术一般分为两大类:基于drop-baseddPCR(ddPCR)和基于chamber-based dPCR (cdPCR)。 ddPCR具有最高的灵敏度和准确性,因为它可以实现乳液中反应液滴的数量最多,但这种平行液滴群体的生成和转移需要时间和复杂的操作。cdPCR有许多预制的微、纳米或皮升油层。与ddPCR相比,cdPCR具有包间大小均匀、加载样品速度快、交叉污染最小等优点。

然而,复杂的制造工艺增加了成本,限制了腔室的数量。此外,这些dPCR方法大多使用荧光团作为信号标签,需要昂贵的高灵敏度荧光显微镜或流式细胞仪等专用仪器进行信号检测,可能面临高背景噪声等挑战。因此,一种低成本、低背景噪声、简单灵敏的dPCR方法仍然是满足dPCR作为常规程序在正常流产和临床应用中的迫切需要。光束法是一种乳化液数字PCR技术。在光束传输中,单个目标DNA被放大到单个磁珠上,磁珠被包裹在油包水(W/O)乳剂的液滴中。扩增后,将目标DNA的群体转化为目标磁珠的群体,磁珠上覆盖着成千上万的目标DNA拷贝。通过对靶珠数量的计数,可以确定靶DNA的初始数量。该团队开发了一种新的基于波束形成、微球和微柱阵列芯片的dPCR方法,原理图如下。

图1 (a)和(b)混合磁珠和上游引物及样品;(c)乳化混合物及聚合酶链反应; (d)放大单目标DNA;(e)液滴破碎;(f)捕获改性聚苯乙烯微球;(g)从微球上分离游离磁珠;(h)捕获磁珠阵列芯片。 

1 (a)和(b)混合磁珠和上游引物及样品;(c)乳化混合物及聚合酶链反应; (d)放大单目标DNA;(e)液滴破碎;(f)捕获改性聚苯乙烯微球;(g)从微球上分离游离磁珠;(h)捕获磁珠阵列芯片。

芯片的制作流程,见图2,首先,将光刻胶自旋涂覆在硅片上,并采用光刻工艺进行图形化,。在此基础上,采用深反应离子蚀刻技术进一步形成晶圆内的微孔阵列。然后用浓硫酸清洗硅母材。PDMS[预聚物与交联剂的比例为10:1 (w/w)]板坯成型前,母材在真空下连夜暴露于三氯气(1H、1H、2H、2H-全氟辛基)硅烷(Sigma-Aldrich,USA)蒸汽中,以降低表面能,促进PDMS板坯从硅母材中后续释放。然后混合物被倒在硅烷主和孵化30分钟,形成一个结构板。固化后,板被剥离,并穿孔,以创建进出口端口,最后通过等离子体处理将PDMS板与玻片牢固粘结。

图2 芯片制作流程 

2 芯片制作流程

为了获得较为均匀和合适的液滴尺寸,测定了组织溶栓的振动频率。我们在20s固定的振动时间内尝试不同的频率,发现在32Hz以下的乳液具有相对均匀的水滴大小(图a)。大多数乳剂的直径是10至15μm。根据这个尺寸,我们估计的乳液中混合将包含约2.4×10-8×107滴。(b)磁珠与液滴的比例很重要。磁珠过多,一个液滴可包裹多个磁珠;磁珠过少的话,会影响回收率。(c)为了评价乳液的质量和热稳定性,将乳液滴在玻片上,发现乳液中液滴的大小和均匀性在热循环后没有发生变化,这说明了在PCR过程中乳液的热稳定性。

图3 a) 乳液中液滴的性质。(a)不同振动频率下乳液的特性;(b)一个乳状液舱内的单颗珠子的照片;(c)乳液热循环前(左)和热循环后(右)的照片。 

3 a) 乳液中液滴的性质。(a)不同振动频率下乳液的特性;(b)一个乳状液舱内的单颗珠子的照片;(c)乳液热循环前(左)和热循环后(右)的照片。

在破乳过程中,磁珠有一定的损失。珠子的回收率很重要,因为回收率低可能会给结果带来较大的检测误差,所以我们对乳液破碎过程中磁珠的回收率进行了评估(图a)。在第一次破坏后,珠子被离心,然后用磁铁收集。将收集到的磁珠悬浮在与基准体积相同的位置,用分光计进行测量,共回收磁珠总量的55%左右。然后将上清液移到另一根试管中,再次重复破碎和收集的过程,大约有5%的磁珠。第三次,就几乎没有。确定了微球的平均回收率为60%。

图4 磁珠的回收率及其对检测的影响。 

磁珠的回收率及其对检测的影响。(a)磁珠在不同破碎时间的回收率;(b)在回收率为60%的情况下,对不同数目的tamb进行检测,总体检测错误;(c)60%的检测率下,检测不同数量的TAMB时的CV值。

图5 (a)上清液中游离微球和沉淀物中MBCs,研究了不同洗涤次数后残留微球的数量。(b)经过1次、2次洗涤后,残余微球数量急剧减少,3次洗涤后逐渐减少,说明大部分游离微球已被洗涤3次后清除。确定理想的洗涤时间是4。 

5 (a)上清液中游离微球和沉淀物中MBCs,研究了不同洗涤次数后残留微球的数量。(b)经过1次、2次洗涤后,残余微球数量急剧减少,3次洗涤后逐渐减少,说明大部分游离微球已被洗涤3次后清除。确定理想的洗涤时间是4。

图6 定量检测目标DNA 

6 定量检测目标DNA。(a)定量检测结果标准样品浓度范围为0.1fm(≈60copies) ~5fm(≈3000copies);(b)一系列临床样本稀释的定量检测结果。右边的数字表示每个样本浓度中计算的MBCs。

点评:

1.本文提出了一种基于微球、乳剂、放大、磁(束)、微球和微柱阵列芯片的核酸定量方法。我们利用链霉亲和素(SA)改性聚苯乙烯微球捕获生物素包覆的靶珠,该靶珠可以代表靶DNA的总体。然后将微球-微珠复合物收集到微柱阵列芯片中,在普通显微镜下观察。由于微球-珠粒配合物的数量与靶DNA的数量呈耦合泊松分布关系,因此通过计算芯片捕获微球的数量可以很容易地推断出靶DNA的数量。

2.该方法降低了成本,降低了数字PCR技术的难度,有望促进数字PCR技术在科研和临床领域的应用。

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