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影响PCR扩增的因素

       引物:在Tris缓冲液中,引物可以低温保存相当长的时间。除非有核酸酶的污染,引物一般非常稳定。笔者使用过10 年前的引物,仍然好用。问题的关键在于您的引物设计是否合理,使用过程是否规范。如果您怀疑引物有问题,可以选择重合。如果重合后,还没有改善,请查其他 原因。引物到用户手头前都是以干粉形式存在的,干粉很容易丢掉,引物溶解后可以测定一下OD,将所有引物的浓度调整到一致,对实验有一定帮助。

 

       高温聚合酶:高温聚合酶是非常稳定的,除非有蛋白酶的污染。但是不同公司提供的酶扩增是有差异的,活性定量和标示未必相同。选用表现一贯稳定的酶,而不是最便宜的。

 

       dNTP: dNTP是PCR扩增体系中最不稳定的,反复冻融会使dNTP发生降解。dNTP是由 dATP,dCTP,dGTP,dTTP等摩尔组成,但是他们的稳定性不同,发生降解的程度不同,导致4种dNTP的浓度不一致,即使不发生降解,4 种 dNTP如果浓度不等,PCR效率和正确率都会受到影响。建议分装小包装,减少反复动容冻融的次数。

 

       缓冲液:缓冲液一般不容易出问题,只是使用前需要彻底融化混匀使用。如果您PCR不熟悉,使用含Mg的缓冲液。缓冲液中可以加入适量的甘油、DMSO等增强剂,目的是改善高GC含量等疑难模板的扩增。

 

       Mg2+:是TAQ活性所必须的,浓度过高过低对反应都有比较大的影响。过低(<1mM),合成效率会下降,过高(>3mM),非特异性会加大。很多因素会使Mg2+的实际浓度受到影响,如TE中的EDTA, 反应用的dNTP等都会螯和Mg.

 

       温度:变性和退火温度是主要需要考虑的。变性温度过高(一般在90-94C),时间过长(一般45-60秒足够),酶的活性会受到影响,同时影响产率。对于退火温度,过低非特异性扩增增加,过高产率会下降。需要根据引物的长度,用途,组成确定退火温度和时间。

 

       模板:PCR 的关键之一,模板不是越多越好。可以通过倍比稀释来确定合适的浓度。纯度,不是最重要,但是不能有抑制Taq活性或螯和Mg 的试剂存在。模板的pH值接近中性为合适,否则会影响扩增体系的pH值。

 

      (转自:苏州汶昌芯片官网)


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