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常见组织细胞的培养方法

常见组织细胞的培养方法

体内组织细胞在体外培养时,所需培养环境基本相似,但由于物种、个体遗传背 景及所处发育阶段等的不同,各自要求条件有一定差别,所采取的培养技术措施 亦不尽相同,现介绍个别组织细胞培养的要点如下:

第一节 上皮细胞培养


上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分,又由于癌起源于 上皮组织,故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细 胞,培养时生长速度往往超过上皮细胞,并难以纯化,同时上皮细胞难以在体外 长期生存,因此纯化和延长生存时间是培养关键。 体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜, 因此培养在有胶原的底物上可能利于生长, 另外人或小鼠表皮细胞培养在以 3T3 细胞为饲养层(用射线照射后)时,细胞易 生长并可发生一定程度的分化现象。降低 PH、Ca2+含量和温度,向培养基中加 入表皮生长因子,均有利于表皮细胞生长。 以表皮细胞为例, 用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞, 其法如下 (黑 木凳志夫 1981) 


1、 取材: 外科植皮或手术残余皮肤小块, 早产流产儿皮肤更好, 取角化层薄者, 切成 0.5-1 平方厘米小块。 


2、置 0.02%EDTA 中,室温,5 分钟。 


3、换入 0.25%胰蛋白酶中,4℃过夜。 


4、分离:取出皮块,用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。 


5、取出表皮,剪成更小的块后,置 0.25%胰酶中,37℃,30—60 分钟。 


6、反复吹打,制成悬液。 


7、培养:用 80 目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸去上清。 


8、直接加入培养基(Eagle 加 20%小牛血清)制成细胞悬液,接种入培养瓶,CO2 温箱培养。


第二节 内皮细胞培养

内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞,对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血 管生长因子(TAF)等有很大价值。 研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便,其法如下: 


1、产后新鲜脐带,无菌剪取 10—15 厘米长一段,如不能立即培养,可于 12 小 时内保存于 4℃。 


2、用三通注射器吸取温 PBS 液注入脐静脉中洗去残血,在入口处用线绳扎紧, 以防液体返流。 


3、用血管钳夹紧脐带一端,从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为 0.1%的粗制 胶原酶,充满血管,消化 3—10 分钟;注入口用线绳扎,以防液体返流。 


4、吸出含有内皮细胞的消化液,于离心管中,注入温 PBS 轻轻反复冲洗后,一 并注入离心管中(此步骤可重复) 。

5、离心去上清,加入 RPMI1640 培养液制成细胞悬液,接种入培养器皿中,置温 箱培养。两至三天可见细胞长成单层。

第三节 神经细胞培养

神经细胞(神经元)不易培养,只有在适宜情况下,如接种在胶原底层上,或加 入神经生长因子和胶质细胞因子时,可出现一定程度的分化,长出突起等现象, 但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。 人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养,不仅能获得生长的胶质细胞,也可 形成能传代的二倍体细胞系。一般说来,胶质细胞在培养中生长不稳定,不易自 发转化, 但对外界因素仍保持很好的敏感性, 可用 ROUS 病毒和 SV4 等诱发转化。 设备: 无菌操作设备。 


一、设备 培养箱:恒温 5%、10%CO2 维持培养液中 pH 值。 


二、大型设备 CO2 培养箱 倒置显微镜:用于每天观察贴壁细胞生长情况。 解剖显微镜,用于准确地取材。 常温冰箱:-4℃,用于保存各种培养液,解剖液和鼠尾胶。 低温冰箱:-20℃--80℃,用于储存血清酶,贵重物品和试剂。 电热干烤箱:用于消毒玻璃器皿。 高压消毒锅:用于消毒培养皿,手术器械。 过滤器:配制解剖液、培养液,必须过滤后才可使用,以去除细菌。 渗透压仪,pH 剂,天平等。 


三、培养器皿及手术器械 1、培养皿:常用 35mm 塑料及玻璃皿,解剖取材用 15mm-90mm 直径。 2、培养板,24-40 孔,可用于开放培养。 3、培养瓶: 4、吸管,常用 1,5,10ml,均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。 5、各类培养液贮存器。 6、小型手术器械。 


准备: 


一、配制培养液 解剖液: (1)解剖液:以无机盐(去除 Ca2+ , Mg2+)加葡萄糖配制成 PBS 缓冲液,保 持一定的渗透压和 pH 值。 基础培养基(MEM) :主要为多种氨基酸,加入葡萄糖,双蒸馏水溶解。 (2)基础培养基(MEM) : 接种培养液: (3)接种培养液:用于胰酶消化后的细胞分散,做成细胞悬液,其成分为 MEM 含 1%谷氨酰胺,另加入 10%马血清,当天配制。 维持培养液:接种后 24h,全部换成此液,后每 2 周换一次,每次换 1/2。 (4)维持培养液 其成分为 MEM 中含 5%马血清,1%谷氨酰胺,及适量的支持性营养物质。 


二、培养基质 常用鼠尾胶、小牛皮胶,多聚赖氨酸,再涂胶 消毒培养皿的备用。所有培养器皿均需清水冲洗 2-3d,达两次 ddH2O,每遍 三、消毒培养皿的备用 洗刷 3-4 次,加塞包装,置于烤箱中干燥消毒,于培养前 1 天进行。 神经细胞分散培养 


(一)选材 常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄 6-8d,新生鼠或胎 鼠(12-14d)或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以 19d 为宜, 小鼠以 18d 为宜,大鼠纹状体以 10d 为宜;若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚, 则黑质以 13d,纹状体 18-21d 为宜;小脑以 20-21d 小鼠胚胎,所获蒲氏细胞成活率高,颗粒细胞正在分化;脊髓与 DRG 联合培养,常用 4-7d 鸡胚或 12-14d 小鼠胚胎,取材易,神经成活率高。  


(二)取材。脑则取出相应组织,在解剖液中先剪碎,以使胰酶消化。脊髓则固 定于琼脂板上,用小刀将其要成背腹两侧,分别培养。 


(三)细胞分离与接种 细胞分离与接种。神经组织用 0.125-0.25%胰蛋白酶在 37℃孵育 30min, 移入接种液,停止消化,并洗去胰蛋白酶液,用细口吸管吹打细胞悬液,使其充 分分散,如此多次,待沉淀后吸出上层细胞悬液,计数,预置细胞密度,接种于 培养皿(1×106) ,做电生理应为 5×105 或更低。 


(四)抑制胶质细胞生长 或 5-FU 抑制神经胶质细胞的生长。 抑制胶质细胞生长。培养 3-5d 后,也有人认为培养 7d 后,用阿糖胞苷。 


(五)观察。接种 6-12h,开始贴壁,并有集合现象,细胞生长突起明显,5-7d 胶质细胞增生明显,7-10d 胶质细胞成片于神经细胞下面,形成地毯,2 周时神 经细胞生长最丰满,四周晕光明显,一个月后,有些神经细胞开始退化,变形, 甚至出现空泡,一般培养 2-4 周最宜。 但神经细胞只能增大,而不能增殖,只能原代,不能传代,不会有细胞周期,而 且随培养时间的延长, 细胞数量在下降, 但胶质细胞可以, 神经胶质细胞也可以。 在培养过程中,早期 9-12d 时,有较多的神经细胞死亡,这是第一次死亡阶段, 应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多,且相互形成 突触。 常用培养细胞实验有: 


(六)常用培养细胞实验有:FCM 的蛋白总量分析;膜片钳与离子通道的分析; 免疫组化分析; 但免疫组化分析应注意,由于抗体直接作用于活细胞,不易穿透活细胞,故对核 内抗原定位时,首先考虑膜对抗体的通透性问题。常用化学试剂以增加其通透性 或采用冰冻方法解决。 在免疫组化中,或其它组织学染色中,常用不同的染色方法以区分不同细胞,如 半乳糖脑苷脂对小树突胶质细胞标记明显;GFAP 对星形胶质细胞具有特异性染 色等。这对研究神经系统中胶质细胞功能具有极大的应用价值。神经胶质细胞以 往多被忽视,其在脑血管疾病(如缺血性损伤) 、退行性疾病(如 AD、PD) 、损 伤后胶质细胞的填充等具有不可忽视的作用。 它也是神经细胞功能和营养支持的 物质基础。

第四节 肌组织细胞培养

各种肌组织均可用于培养,以心肌和骨骼肌较实用。 


(一)骨骼肌细胞培养 


1、出生 1 一 2 天的乳鼠,引颈处死。 


2、无菌取大腿肌组织,切成 0.3 一 0.5cm2 小块后,用不含钙镁离子的 Hanks 液配的 0.25%胰蛋白酶消化,无菌纱网或纱布滤过。 


3、计数调整细胞密度。 


4、快接种量 2×106/皿入培养基培养。 


5、培养基内含 10%小牛血清,可加 1%的胎汁以促进分化。 接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化,明胶配置:用 Hanks 液配成 0.01% 明胶。 该细胞接种率约 50%,细胞生长开始呈纺锤形,培养 50-52 小时后出现融合形 成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止,此时可观察到横纹,一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。 


(二)心肌细胞培养 


心肌细胞是最早的培养材料,Carrel 曾长期培养过心肌组织,至今心肌仍不失 为好的培养物,最常用的是鸡胚心肌。 心肌比较容易培养和生长,可用悬滴培养、组织块培养和消化培养法,均可获良 好的效果。取心室肌培养较好,原代培养的鸡胚心肌呈纺锤形,培养成功时,一 周后可见节律性收缩现象。

第五节 巨噬细胞培养

巨噬细胞属免疫细胞,有多种功能,是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的 重要对象。巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细 胞群,在条件适宜下可生活 2-3 周,多用做原代培养,难以长期生存。 巨噬细胞也建有无限细胞系,大多来自小鼠,如 P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等,均获恶性,培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能,易于传代和瓶壁分离,但难 以建株。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞, 以小鼠腹腔取材法最为实用, 其法如下: 1、实验前三天,向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤 lml(勿注入肠内!,以 ) 刺流产生大量的巨噬细胞。 2、引颈处死小鼠。 3、手提鼠尾将其全浸入 70%乙醇中 3-5 秒。 4、置动物于解剖台,用针头固定四肢,持镊撕开腹部皮肤,但勿伤及腹膜壁, 把皮肤拉向上下两侧,暴露出腹膜壁。 5、用 70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸 10ml Eagle 液注入腹腔中,同时用手指从 两侧压揉腹膜壁,使液体在腹腔内流动。 6、 用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧. 使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。 7、小心拔出针头,把液体注入离心管。 8、4℃下 250g 离心 10 分钟后,去上清,加 10ml Eagle 培养基。 9、计数细胞。每只鼠可产生 20 一 30×106 细胞,其中 90%为巨噬细胞。 10、以 3×105 个贴附细胞/平方厘米接种。 11、接种数小时后,除去培养液,可去除其它白细胞,纯化培养细胞,用 Eagle 液冲洗 1 一 2 次,再加新 Eagle 培养液置 CO2 温箱中。 


第六节 肾小球分离、移植培养


SD 大鼠颈椎脱臼法处死,75%乙醇浸泡 1~2 分钟,2 次,置超净台内,打开腹腔 取出肾脏剪碎,置含 Hank's 液的无菌培养皿洗涤,置 80 目不锈钢筛网上。用扁 平自制小铲轻轻碾磨产物微小组织透过筛网,滤过组织 Hank's 液混合物用吸管 吸至 120 目不锈钢筛网,滤过,去小组织块,滤过物吸至 200 目不锈钢筛网,轻 轻滤过, Hank's 液洗涤 1 次, 收集网上肾小球, 镜下观察为分离良好的肾小球。 肾小球用 0.2%胰酶、0.1%胶原酶,37℃消化 20 分钟,加血清终止胰酶反应,离 心除去胶原酶。处理过的肾小球计数后接种至 24 孔培养板或 25ml 培养瓶,使肾 小球大于 60 个/cm2,加培养基 5~10ml(培养基组成:F12—3T3 上清 1:1;5% 马血清;2.5%胎牛血清;胰岛素 5μg/ml;25ng/ml 氢化可的松;5μg/ml 转铁 蛋白;25ng/ml 前列腺素 E1;甲状腺素 0.02ng/ml;D-缬氨酸 150ng/ml)肾小球培养 8~10 天,去除肾小球未生长组分,细胞继续培养 24 小时,形态学观察: 细胞生长成单层多角型细胞,直径约 100μm。

第七节 裸小鼠移植瘤单细胞分离培养

无菌条件下取出小鼠移植瘤组织,剪成 1mm3 小块,用 0.5%胶原酶室温消化 30 分钟到 1 小时,再加等体积 0.2%胰酶消化 5~8 分钟,在消化过程中用吸管吹打 组织块或用自制装置 (分别作为加样和收集器的两个注射器中间加一小滤器连接 而成,滤器中间垫两层丝质材料以隔断组织块与单细胞)来回推动注射器吹打组 织以分离单细胞,终止酶消化方法同上。 常规方法接种培养收获细胞。