未培养微生物分离培养技术研究进展-汶颢股份
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未培养微生物分离培养技术研究进展

近年来越来越多的证据表明,活性氧簇具有生长抑制效果,例如过氧化氢能够导致氧化应激和细胞损伤,由于在人工生长培养基中产生了过氧化氢,导致微生物的生长效率明显降低。虽然分子生态学和宏基因组学已经明显增加了我们对于微生物多样性的了解,并且引导产生了许多有趣的假设,但是这些先进的技术也显示出我们距离充分阐明微生物多样性还很远。同时,考虑到许多基因储存在具有未知功能或错误注释的数据库中,仅使用宏基因组学的方法不能提供足够的信息去培养所有的微生物。实际上,只有通过细菌纯培养的研究才能充分地阐述其表型和基因型。考虑到微生物培养在现代微生物学中的重要性,分离培养未培养微生物仍然是优先考虑的思路。因此,一个重要的挑战就是如何克服目前存在的限制因素,扩大可培养的范围。本文将综述目前未培养微生物分离培养技术研究进展(表1),为分离未培养微生物和研究其生态学功能提供参考。

表1微生物分离培养新方法 

1未培养微生物的限制因素

1.1 培养基组分和生长条件不全面

任何微生物的生长都需要能量、营养和适当的物理化学成分,并且不同的微生物所需的浓度是不同的。某些微生物在生长的过程中,需要特殊的营养物质、pH条件、培养温度和合适的氧气浓度。Köpke等研究不同的培养基基质和培养条件对微生物生长的影响后发现,不同的条件下微生物生长出现明显差异。

1.2 忽视了环境中微生物之间的相互作用

自然环境中的大部分微生物都是群体生活,并且相互之间建立了复杂的关系。在实验室培养条件下,单纯地将待培养的微生物与其他相关的微生物群体分开,物种之间的信息交流被阻断,微生物因缺乏必需的生长因子和信号分子而无法生长,表现为不可培养。在原核生物中,种间互作普遍存在并且不会受到信号分子的限制,例如自体诱导分子2(AI-2)和N-酰基-高丝氨酸内酯。

培养时间短

在某些情况下,培养效率随着培养时间的延长而明显增加。许多微生物,特别是生活在营养不充足环境中的微生物生长速率是很慢的。因此,延长培养时间是提高这类微生物培养效率的先决条件。Davis等培养土壤微生物至少12周的时间,结果显示菌落计数明显增加并且分离出几株之前未培养的菌株。

检测灵敏性受限

对于某些微生物生长速率慢、产量低的情况,如果检测技术灵敏性不高,很可能得出错误的结论,因此开发多种高灵敏性检测方法对于认识未培养微生物具有很大的作用。对于要通过菌落数量来研究其生理生态特性的微生物,高灵敏性的检测方法如切向流过滤是极其重要的。

2未培养微生物培养分离技术

2.1调整培养基

在生长的过程中,许多微生物有特殊的营养物质和化学物质的需求。这就需要对微生物生存的自然环境和特性有深刻的理解,包括与培养基生长直接相关的各种因素,才能有助于研究者更好地理解这些因素并进一步开发培养未培养微生物的方法。最近的一些研究探究了不同成分和浓度的培养基对于培养未培养微生物的影响。Li等应用体外培养方法,在厌氧培养基中添加十八碳烯酸(TVA)至不同终浓度(0、30、40、50、60μg/mL),接种瘤胃微生物后进行连续和传代培养,传代富集培养时,用DGGE监测菌群变化,发现当传至第4代,TVA氢化菌群的数量增加最显著,对差异条带的测序结果表明这些细菌大多属于未培养的瘤胃细菌Davis等和Sait等参考系统发育相关菌种,通过修饰和富集培养基成功地分离出之前未培养的微生物。微生物学家通过在培养基中加入氢氧化铁和锰氧化物作为电子受体,实现了微生物的高效培养,例如变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、疣微菌门和盐单胞菌门。Kashefi等根据嗜高热微生物利用Fe(III)作为终端电子受体这一高度保守的特性,在培养基中添加非常微量的Fe(III)氧化物。该方法的前提是对微生物特性有一定的了解。Santini等从Aodaliya金矿中分出以亚砷酸为电子供体,氧为受体,以CO2为唯一碳源的优能自养菌(NT-26),16SrRNA基因序列分析表明,NT-26属于α-Proteobacteria土壤杆菌的一个根瘤菌分支,可能是一新种一些研究关注甲烷厌氧氧化对于硫酸盐或硝酸盐的还原作用。这些方法需要精确的培养基,其中包括碳氢化合物能量来源和硝酸盐,铁和硫酸盐作为电子受体

对来自北海的样本进行的研究显示,碳源的品质是决定培养效率的关键因素。包含不同碳源和复杂化合物的培养基所培养出的微生物数量和多样性比只含有一种碳源的培养基更高。相反地,许多自养微生物不能在只有一种固定碳源的培养基中生长。目前,通过使用低底物浓度的培养策略,针对未培养微生物的培养已经取得一些成效。放线菌门、酸杆菌门、变形菌门和疣微菌门利用低营养培养基和增加培养代数进而被成功地培养。改善培养条件(如营养水平,氧气浓度,腐殖酸的添加和信号分子)也增加了一些新型微生物。最近,科学家创新地开发出高选择性培养基,最大的优势是该培养基对特定的微生物具有高选择性。这种方法被用来开发选择性培养基培养水稻细菌性谷枯病菌、燕麦食酸菌、果胶杆菌、青枯雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌(表2)。在培养基中添加腐殖酸、信号分子、处理活性氧的酶类或移除某些抑制因子提高未培养微生物的培养性。一些微生物学家证实吉兰糖胶对于未培养的微生物的培养和分离是有效的,因为它的平板成分比琼脂要更清楚,因此更容易找到非常细微的菌落。吉兰糖胶也可能增强受琼脂抑制的微生物的生长。吉兰糖胶培养基上的菌落计数是琼脂培养基的10倍。生长在吉兰糖胶培养基上大约60%的微生物被认为是新的,在同样的条件下,新分离得到的微生物中的一半在琼脂培养基上不能形成菌落。

表2 培养 

2.2群体培养

2.2.1共培养

在自然环境的微生物区系中,微生物间的相互作用对于群体生存是至关重要的,但是由于内在的复杂性和实验室培养的困难性,这些相互作用间的确切机制仍然是不清楚的。传统的以培养为导向的研究并不能解释由信号分子介导的相互作用,这些信号分子严重地限制了对于未培养互养微生物的研究。因为微生物总是会在一个群体中与其他微生物建立一种关系,并且这些相互作用一方能够竞争有限的资源,另一方面也会通过代谢物和信号分子的交流进行合作。微生物之间相互交流的典型的例子比如生物膜和多细胞培养装置,都可以实施单个物种培养不可能实现的多功能培养。例如,混合细胞组合能够完成多级纤维素降解,并且产物中间体能被作为碳源进行利用。Park等开发了一种简易的微液滴装置用于高效培养互养微生物群体,同时来证明其在微生物间协同共生中的效果。微液滴装置是单分散液滴中封装和培养微生物群体中的小单元。如果液滴将有互作关系的微生物局部化,那么这些微生物将能够分裂生长(图1A)。倾斜的T形连接用于液滴的产生,反应室用于保留液滴进而进行培养(图1B,C),这个倾斜的T形连接能够产生均匀分散的液滴,在入口的压力下,至少1400个液滴能够被非常紧密地包裹在10mm×5mm的反应室内(图1D)。

共培养也是一种培养兼性或互养微生物的有效方法。到目前为止,两种成功的例子已经被报道:(1)一种利用透析膜反应器的群体培养方法已经成功地从厌氧淤泥中培养出厌氧嗜热的降解谷氨酸的微生物。(2)另一种利用在厌氧和需氧交替的间歇反应器中的群体培养成功富集到混合微生物。新的微生物通过与耗氢型微生物共培养或使用适合生长的纯培养基质得以成功地鉴定。另外,在很多情况下,不同技术结合使用已经取得了成功。例如,通过将适合生长的环境条件与辅助菌株结合使用,Nichols等培养出一种新的嗜冷杆菌属。辅助菌株提供了必要的生长因子,这些生长因子对于使用人工培养基培养未培养菌株是重要的发现。其他的研究者已经使用非共生的变形虫作为一种工具来分离环境样品中(包括土壤)新的胞内微生物[40]。

图1用于共培养的微流体装置 

1用于共培养的微流体装置

注:A:利用共培养空间检测微生物间的共生关系;B:微流体装置原理图;C:微流体装置实物图;D:微流体装置内液滴形成反应室.

2.2.2原位培养

模拟目标微生物的自然环境进行原位培养和分离是目前研究者的一个基本策略。Kaeberlein等模拟海洋微生物自然生长的环境,设计出名为扩散生长盒(Diffusiongrowthchamber)的自制培养仪器(图2),使用这种仪器来分离培养微生物。该扩散盒由一个环状的不锈钢垫圈和两侧胶连孔径为0.03μm的滤膜组成,滤膜既允许有益的小分子代谢物质和圈内外微生物产生的活性物质透过膜自由进出小室,化学物质在盒内和环境之间进行交流又不能让微生物细胞通过造成逃逸,因此使高密度培养成为可能。扩散盒内加入被分离的环境样品即海洋微生物样品与琼脂的混合物,封闭后置于模拟采样点环境条件的玻璃缸中进行培养,并不断注入新鲜的海水循环流动。1周后,培养基上产生大量形态各异的微型菌落,数目高达接种微生物的40%,微菌落中多数为混合培养,需再次分离以获得纯种。最后从海水中分离到一株新的菌株。不同类型膜基系统已经被开发出来在自然环境中直接生长微生物群体。来自土壤、海洋或活性污泥中的未培养微生物被培养在扩散生长盒中。据此得出了这种假设:在扩散生长盒里环境中原位培养的原核生物一方面进行充分的菌株富集为了随后的分离并移入传统的固体培养基,另一方面在试管培养条件中使菌株适应抑制性的条件。有趣的是,很多缓慢生长的菌落应用该方法也可以被成功培养。研究者已经在模拟的自然环境中通过使用扩散生长盒测试了未培养微生物的培养性并取得了成功的结果在此基础上,科研人员开发了一种新的高通量平台用于大量培养和分离环境中的未培养微生物,这种平台被称为分离芯片(Isolationchip,Ichip)。Ichip由数百个微型扩散室组成,每个室可接种单个的环境细菌。通过这种方法,使研究者研究那些不能人工培养微生物成为可能。这种方法的合理性在于,可以让一些自然生长因子通过扩散进入到培养室内,从而有助于培养室内的细菌生长。结果表明,通过这种方法分离到的细菌大大超过了传统分离方法得到的细菌。Nichols等设计并测试一种分离芯片(Ichip)(图3),先把中央平板浸到目标细胞悬液中进行培养,进而转到琼脂培养基中,等培养基冷却后固定下来,平板两边附上薄膜经过挤压彼此分开(图3)。通过这种芯片分离得到约40%海水微生物种类和50%土壤微生物种类,其中海水样品中具有62个(28.3%)、土壤样具有86个(28.7%)纯培养微生物的16SrRNA基因相似性小于95%。这个方法可以