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微流控芯片与体育科技研究

摘要:近年来,微流控芯片实验室已经被应用到生物化学技术的各个方面,该技术有可能为后基因组时代的基因组学研究提供一个更为强大的平台,并在基础医学、药学和临床医学等领域呈现出广泛的应用前景。如何应用这种高通量、高效率、低消耗的芯片技术为体育科研服务是一个值得思考和探究的问题,就此进行了探讨。 

 

1 微流控芯片技术概述 
   
  1.1 微流控芯片

         微型全分析系统又称为芯片实验室,是一个跨学科的新领域,是通过分析化学、微机电加工、计算机、电子学、材料科学及生物学、医学的交叉实现化学分析系统,从试样处理到检测的整体微型化、自动化、集成化与便携化。微流控分析芯片是微型全分析系统的主要组成部分,是以常规毛细管电泳原理为基础,通过微细加工技术将微管道、微、微阀、微储液器、微电极、微检测元件、窗口和连接器等功能元器件像集成电路一样,使它们集成在芯片材料(基片)上,实现样品进样、分离、反应乃至在片检测的微全分析系统。它以分析化学为基础,以微机电加工技术为依托,以微管道网络微结构为特征,以生命科学为目前主要应用对象。

 
  微流控芯片的早期形式是芯片毛细管电泳。根据芯片材料的不同可分为硅芯片、玻璃芯片、石英芯片、高聚物芯片和复合材料芯片;根据功能的不同可分为高分辨分离芯片、微采样芯片、微检测芯片、细胞分析芯片、前处理芯片、化学合成芯片、多功能集成化芯片。每一个芯片实验室都将被赋予一定的功能,因此形成功能芯片系统,大体包括三个部分:一是芯片;二是信号的检测收集装置;三是包含有实现芯片功能化方法和材料的试剂盒。所涉及到的部件包括:和进样及样品处理有关的透析、膜、固相萃取、净化;用于流体控制的微阀(包括主动阀和被动阀)、微泵(包括机械泵和非机械泵);微混合器、微反应器、微通道和微检测器等。其制作工艺包括芯片的基体加工及表面加工、键合和粘接等。 


  微流控芯片把整个生化验室的功能,包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微芯片上,且可多次使用。因此具有广泛的适用性。微芯片分析系统的出现不仅可使珍贵的生物试样与试剂消耗大大降低到微升甚至纳升级,而且使分析速度成百倍地提高,费用也相应下降,从而为分析测试技术的普及创造了条件。近年来,微流控芯片技术在以下几方面得到了发展:微流控分析系统从以毛细管电泳分离为核心分析技术发展到液-液萃取、过滤、无膜扩散等多种分离手段,具有广泛的应用前景;微流控分析系统从单道检测发展到多重平行检测;微全分析系统从成分分析工具发展到包括在线检测的微型化学反应与合成手段;在新药物筛选中显示出强大的生命力;微流控分析系统具有多种检测手段,如电化学、质谱、原子光谱、光声光谱、化学发光等。由此可见,微流控芯片在生物化学分析中具有显著优势,这种生化检测可以提高分析速度,增加分析效率,减少样本和试剂的消耗,排除人为干扰,防止污染以及完成自动高效的重复实验。分析系统的微型化可以使野外实验室变得很简单,芯片实验室的潜在应用范围包括高效筛选、环境监测、临床监测、空间生物学、现场分析、生物战争试剂检测、高效DNA检测等。 


  1.2 微流控芯片与基因芯片 

          20世界90年代初由瑞士的Manz和Widmer提出了以微机电加工技术(microelectro-mechanical systems,MEMS)为基础的“微型全分析系统”(micrototal analysis systems,μTAS)。μTAS可以分为芯片式与非芯片式两大类,其目的是通过化学分析设备的微型化与集成化,最大限度的把分析实验室的供能转移到便携式的分析设备中。目前,芯片式是发展的重点,即最大限度地把分析实验室的供能集成到方寸大小的芯片上,实现所谓的“芯片实验室”(lab-on a-chip,IDC)。在芯片式μTAS中,依据芯片结构及工作原理又可以分为微阵列芯片和微流控芯片。微阵列芯片目前的应用对象是DNA分析,也称DNA芯片、基因芯片或生物芯片。生物芯片技术的实施包含三个基本元素:1)生物探针分子的获得;2)探针分子的表面固定和对样品的识别;3)识别结果的检测和分析。有关基础研究始于20世纪80年代末,主要是在生物遗传学领域发展起来的。而微流控分析芯片是1990年提出的μTAS主要发展方向,主要是在分析化学领域发展起来的。在目前的学术刊物中,微全分析系统(μTAS)和微流控芯片(microfluidic chip)指的是同一个概念。其目标是把整个化验室的功能,包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在可多次使用的微芯片上。因此较微阵列芯片应有更广泛的适用性及应用前景。 


  1.3微流控芯片的应用 

         目前微流控芯片已突破其发展初期在加工技术即基本流控技术上的主要难关,正在进入一个开展更深入的基础研究、广泛扩大应用领域,及深度产业化的转折时期。这种微型化、集成化的微流控芯片氨基酸和蛋白质的分离、免疫分析、DNA分析和测序、生物细胞研究等方面显示出巨大的潜力。这必将对疾病诊断和治疗、新药开发、食品卫生等诸多领域产生革命性的影响。 


  1.3.1蛋白质分析 

        微流控芯片的一个重要的应用领域是蛋白质。蛋白质的微流控电泳芯片,通过在玻璃片或硅片上设置各种微泵、微阀、微电泳以及微流路,可将生化实验室的分析功能浓缩固化在蛋白质芯片上,然后在电场作用下,样品中的蛋白质通过芯片上的孔道分离开来,经喷雾直接进入质谱仪中进行检测,以确定样品中蛋白质的分子量及种类。除了蛋白质以外,对更为复杂的糖蛋白的芯片测定也已开始,用电泳技术结合蛋白酶和糖苷酶对蛋白质的处理,在芯片实验室进行糖蛋白中糖链分析的方法已建立。徐良基等利用微流控芯片技术制作石英玻璃材料的微流控芯片,在自行研制的紫外可见吸收检测系统上,实现了芯片上对牛血清蛋白BSA、人免疫球蛋白IgG和人转铁蛋白TRF及它们的混合溶液的分离检测,结果重复性较好。王惠民等依据电荷和分子量的不同,利用微流控芯片技术,在2~3 min内检测到38例尿蛋白阳性患者中,溢出性蛋白尿3例、选择性蛋白尿9例、非选择性蛋白尿26例,8例健康对照未检出蛋白峰。 


  1.3.2免疫分析

         免疫分析是利用抗原和抗体之间的特异性反应来选择性识别和测定作为抗体或抗原的待测物。经过多年的应用与发展,免疫分析已经成为临床诊断、生物医药以及环境化学研究中一种有力的分析手段。降低样品和试剂的消耗量,提高分析速度是免疫分析的重要目标。在微流控芯片上进行免疫分析是对毛细管电泳免疫分析技术的重大革新。这种微片装置是在微型的玻璃片或者硅芯片上采用化学刻蚀等技术产生一些微小的通道来代替传统的毛细管作为电泳分析的场所。这种开放式的通道结构使得在很短的分析长度内就可以满足分析需求,可以大大缩短整个分析所需的时间,并可根据实际需要设计合适的芯片。芯片上可以很容易地刻蚀上很密集的分析通道的阵列,并可高精度地复制生产,大大增加了分析通量。因此,免疫分析在微流体系统中的应用已受到广泛的关注。 

  1.3.3 DNA分析及测序 

 

          微流控芯片可用于迅速分离DNA限制性片段PCR产物,比常规的毛细管电泳分离要快得多。把β珠蛋白的PCR扩增反应缩微集成到硅芯片上,目的基因进行15 min的扩增,然后仅用2 min就可完成PCR产物的分离,整个分析过程不到20 min。混合样品多PCR产物电泳芯片分离,可同时分析10个以上PCR反应产物,尤其适用于基因作图分析,以及遗传性疾病诊断。在微流控芯片上观察荧光标记DNA的重复三联体序列,分离速度是常规毛细管电泳的十几倍。此外,常规DNA测序需要制备微升级的样品,试剂消耗量大。将纳升级的样品制备系统缩微到芯片上进行测序,可在分离前除去多余的引物、盐分、核苷酸等,所用测序体积是Sanger双脱氧链终止法的1/300,测序成本明显降低,而且可进行固相测序。将微流控芯片四色标记法用于DNA测序,可在540 s分离150个碱基,准确率在97%以上。用高分子材料制作的微流控-微阵列芯片,可以用于核酸杂交并对其进行实时检测。而且微流控-微阵列体系还可以检测杂交反应的动力学特性。 


  1.3.4细胞培养与检测

 

         单细胞分析对重大疾病的早期诊断、治疗和药物筛选以及细胞生理、病理过程的研究有重要意义。微流控分析芯片的网络结构和微米级的通道尺寸使简化单细胞分析成为可能。微流控芯片系统用于细胞分析是近年来该技术发展的一个热点,已引起较广泛的关注。利用微全分析系统高度微型化、集成化和设计灵活等特点,通过巧妙设计和精密加工能够实现细胞的培养、凋亡及检测等功能,如细胞操作,绿色荧光蛋白的表达,基因转染,细胞活性测试,细胞分离,细胞内钙离子的测量,激素分泌监测以及高通量的细胞含量分析等。目前,微流控:片系统已被应用在血液流变学、单细胞操纵与计数以及单细胞胞内组分分析等多方面。在微流控芯片通道中,人们利用气压、液压和电压,或利用介电电泳、光学陷阱、行波介电电泳以及磁场等技术,可以操纵细胞通过或驻留在通道内的任意位置,从而使单细胞计数、筛选以及胞内组分分析等操作大大简化。 


  1.3.5药物筛选 

 

          药物筛选是现阶段新药开发的主要途径。高通量药物筛选是近10年来发展起来的药物筛选的新的技术体系。微流控芯片实验室实现药物筛选的基本原理是以酶标为例,即令酶和一种荧光标记的底物反应,使之产生一种荧光产物,用芯片电泳将这一荧光产物和荧光底物或其他荧光本底分离开来。这种方法已经用于蛋白激酶.磷酸酶、蛋白酶、细胞色素和磷酸单脂酶等,芯片上的分离只需几秒,通常变异系数小于10%。用于药物筛选微流控芯片装置有两大类,一类是一次性使用芯片,它采用类似于喷墨打印机的微散射法,把样品和试剂注入芯片的一组通道;另一种以连续流法为基础,它将样品的注射过程、混合过程和功能实现过程在芯片上集成于一体。 

 

  微流控装置的用途广泛,但目前流行的微流控装置最大的不足之处是它们需要大量辅助的外部设备,体积庞大且成本很高,这就极大地限制了它的应用。克服这些困难的一个途径就是将所需试剂装配并存储于微流控体系内部,真正实现“lab-on-a-chip”。有学者预计,最晚到2008年,以微流控芯片为核心的微分析系统将取代当前化学分析实验室的很多设备,使化学分析进入病房、生产现场甚至家庭。在此基础上再经过三五年,能监测自身生化指标及基因变异、食品卫生及环境状况的便携式“个人化实验室”将可能成为现实。 
   
  2 微流控芯片技术与体育科技研究 
   
  中国自1984年重返奥运大家庭以来,在奥运会上取得了喜人的成绩。这些成绩的取得与科研人员参与到运动队中开展科研攻关与科技服务,大大提升科学化训练的水平密切相关。在总结了以往开展科研攻关与科技服务经验的基础上,针对运动员在训练比赛中遇到具有共性和基础性的问题,在新的一个备战奥运会周期中,提出了10个领域的科研工作,即运动员科学选材、运动训练科学化理论与方法的研究与应用、优秀运动员训练监控和机能评定的研究与应用、运动员体能恢复与营养补充的研究及应用、运动员心理咨询和心理训练理论与方法的研究及应用、运动创伤与医务监督的研究与应用、中医药防治运动性疲劳及伤病的研究与应用、反兴奋剂的研究与应用、体育信息与服务的研究与应用、竞技体育综合管理及战略研究。其中,在运动人体科学领域涉及的主要的热点问题有,运动损伤的防治、运动性低血睾酮、运动性低血色素(运动性贫血)、运动性免疫机能低下等的发生机理的研究,以及兴奋剂检测方法的研究,等等。 


  随着教练员、运动员文化素质的提高和运动训练基地科研条件的改善,借助科技手段辅助训练日益被教练员、运动员所接受,甚至有些教练员已经开始尝试根据科研人员的科学检测报告制订训练计划。事实上,对训练进行科学监控已成为当今运动训练(科学)的重要组成部分。目前,常用辅助教练员开展训练、评价运动员体能的指标有,血睾酮、皮质醇、血乳酸、血红蛋白、红细胞谷胱甘肽和活性氧、血清肌酸激酶、血尿素、IgN、IgA、IgG等,其中,监测血睾酮、皮质醇、红细胞谷胱甘肽和活性氧等通常须要采集受试者的静脉血,用分离出的血清与红细胞才能完成监测。然而,运动员和教练员往往不愿接受静脉取血,因此,研发微创、微量(采集末梢血)、快速的分析方法检测生化指标,现场化、及时性地评价运动员体能具有重要的意义,相关方法的研究亟待解决。 


  根据微流控芯片实验室所需样品微量,更具高通量、高效率、短时间等优势,中国科学院林秉承等与我们合作,利用微流控芯片技术进行了血睾酮和皮质醇联合检测芯片,血睾酮、皮质醇联合检测芯片分析仪的研发,目前该工作已完成标准品的检测。如果能够充分发挥微流控芯片技术的优势,研发出不需要用常规的静脉取血分离血清检测的方法,而是以末梢微量全血为直接的检测样品的芯片检测系统,建立通过微量的末梢血就可以快速、准确地完成多项指标的同时检测的运动员体能监控的微创检测方法,那么这将是一个“质”的飞跃。这个飞跃不仅仅会体现在检测方法上,也一定会体现在提高运动员体能上。如果能将这种技术推广应用,必将受到体育科技人员、乃至运动员和教练员的普遍欢迎,具有广阔的市场前景。

 
  另外,利用微流控芯片电泳同时检测细胞活性氧类和谷胱甘肽的技术、单分子光学检测技术、基于毛细管及芯片电泳的分子相互相互作用的研究技术和基因诊断技术引等皆有可能作为研究方法,应用到体育科研中。 


  科学仪器在人类的整个科技的发展中都起到及其重要的作用,这在近代科技发展中反映得尤为突出。重大科学目标会极大地刺激适合其需求的相关技术的发展,而相应的平台技术的突破又能极大地推动重大科学目标的实现。北京2008年奥运会为体育科学的发展创造了千载难逢的契机,同时竞技体育也在不断地给我们提出新的课题。微流控芯片技术在体育科学研究中的应用前景是广阔的。

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