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微流控技术在基因分析研究中的应用

以微机电加工技术(MEMS)为基础的微型全分析系统(μTAS),在近10余年中已经发展为当前世界上最前沿的科技领域之一。该技术是将化学、生物学等领域所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离和检测等过程缩微或基本缩微到一块几平方厘米的芯片上,用以完成不同的生物或化学反应过程,并对其产物进行分析的技术,是一个微而全的系统。目前微流控芯片是μTAS中最活跃的领域和发展前沿,原则上微流控芯片可应用于各个分析领域,如生物医学、新药物的合成与筛选、食品和商品检验、环境监测、刑事科学、军事科学和航天科学等其他重要应用领域,其中生物分析是热点。目前其应用主要集中在核酸分离和定量、DNA测序、基因突变和基因差异表达分析等。本文将对近年国内外利用微流控芯片进行基因分析的研究进展作一综述。

微流控技术在基因分析研究中的应用

聚合酶链反应

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction , PCR)是一种对核酸分子进行体外扩增的方法 ,已经广泛应用于生物医学各个领域,反应的主要操作过程在3个温度区间重复循环,经过酶促反应扩增特定的DNA片段,扩增后的产物可用于诊断疾病、检验组织或血样中的特殊细菌或病毒。常规的PCR过程需要制样、扩增及检测等步骤 ,既费时又费力,而微流控芯片技术用于PCR扩增及相关检测时,既能简化操作步骤,又能显著提高检测效率。目前,反应池内固定扩增式PCR和连续流动式PCR已经成为芯片上PCR扩增的2种主要形式。前者基于静态反应,通过反应池内温度的周期性变化实现扩增,后者是依靠生物样品顺序流过3个不同的温度区实现扩增。

聚合酶链反应

但在多个样品连续扩增时,由于通过人工换样,降低了单位时间扩增的样品数,也增加了交叉感染的可能。为克服以上缺陷 ,有团队研制了具有35个扩增循环的螺旋通道微流控PCR玻璃芯片,在 26 min内成功扩增了质量浓度仅为10 ng/ml的6012 bp的DNA。在芯片内液流由内向外流 ,减少了反应液在微通道中流动时的分散和阻力 ,将小孔径石英毛细管作为顺序注射系统(SI)的连接通路,将死体积降低至0.3 nl,从而完成了扩增过程中微升级样品的自动控制,实现了在芯片上进行多个样品的连续自动扩增、微升级样品的自动换样、连续 PCR 扩增和微通道洗涤等功能 ,样品间无交叉污染。由此可见 ,利用流通式微流控PCR芯片已成功地实现了PCR的快速扩增 ,其优点是扩增速度快,操作简便,使用样品和试剂少,芯片可以重复使用。

核酸分离与测序

微流控芯片分析在生命科学领域的主要应用对象之一是核酸分析。由于在微通道条件下 ,施加电场产生的焦耳热效应低 ,注入的试样量少 ,分子扩散程度低 ,因此微流控电泳分析在核酸诊断分离中的分辨能力远远好于平板凝胶电泳。微芯片的快速高质量的分离效能在寡核苷酸、DNA、RNA片段分析以及基因表型和测序应用中得到充分反映。微芯片上的DNA 基因型分析可以迅速完成基因鉴别,显著提高其在基因组学、诊断学、遗传药理学、法医学检验方面的性能。

核酸分离与测序

10年来,随着微流控分析芯片在技术上的不断完善和发展,微流控分析芯片系统所能分离的DNA 片段的长度也在逐步扩大,可完成对DNA片段的测序和遗传物质的分离、分析,并且出现了可同时进行平行分析的多通道阵列芯片。

多态性检测

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)就是人类基因组中物理图谱的理想遗传标记,能满足对代谢、生长和疾病相关基因的定位。SNP在人类基因组中出现的频率非常高,平均每500~1000个碱基对中就有一个SNP,估计其总数在300 万个以上。

多态性检测

基因多态性是人类各种可遗传变异中常见的现象,主要表现为长度和序列多态性两个方面。长度多态性包括大片段 DNA 插入或缺失引起的基因突变以及高度重复序列中小卫星或微卫星位点的重复串联数目不同而引起的多态性;而序列多态性则来源于单碱基的替换、插入或缺失,也叫基因的点突变。病态下许多突变涉及到大范围的基因缺失或复制。如杜氏肌营养不良(DMD)是一种 X 染色体连锁的隐性遗传病,60 %的患者可伴有抗击萎缩蛋白基因的缺失 ,且主要发生在9个突变热点区。SNP检验方法主要是以PCR为基础 ,通过电泳技术分辨碱基差异造成的DNA片段的各种差异来进行基因分型。

其他

除了应用于基因多态性检测和DNA测序,芯片电泳还可通过PCR产物分析进行外源性病原体基因的快速检测 ,并具有较高的灵敏度和特异性。针对病原微生物基因组的特征性片段、染色体DNA 的序列多态型、基因变异的位点及特征等,设计和选择合适的核酸探针,经PCR 扩增后检测 ,就能获得病原微生物种属、亚型、毒力、抗药、致病、同源性、多态型、变异和表达等信息,为疾病的诊断和治疗提供一个很好的切入点。有关该技术的应用已有报道,应用微流控芯片可同时检测多种病原微生物核酸的PCR产物如乙型肝炎病毒 ( HBV) 、丙型肝炎病毒 ( HCV)、免疫缺陷病毒 ( HIV)、梅毒等。

探针DNA分子是通过微阵列技术印制到基体表面的 ,所要分析的样品由微流控体系加入并与探针反应。该技术吸收了微流控与微阵列两者的优点,微流控体系可以通过调节温度自动控制与微阵列DNA 反应的样品量,同时吸取了微阵列技术中可通过荧光信号对杂交进行实时监测的长处。

经过十几年的发展 ,微流控技术在基因分析中的应用越来越广泛,并不断取得积极和具有突破性的成果 ,由于自身突出的优点 ,可能在不远的将来成为基因分析的主要工具,其技术可以为后基因时代的基因组学研究提供一个更为强大的平台。

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