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微电极的特点、分类、制备方法

微电极芯片制备

微电极是指至少在一维尺度上不大于25μm的电极。微电极由于尺寸小而具有一些常规电极无法比拟的性质,如具有电流密度高、响应速度快、欧姆压降(iR降)小、信噪比高等特点。微电极特殊的性质使其在电化学测试中具有独特的优点和重要性,并在分析化学、生物学及医学等方面得到了广泛应用,尤其在生命分析领域如在单细胞检测和活体分析中具有众多重要的应用。微电极的设计制备是微电极电化学发展应用的关键,目前涌现出的制备微电极的技术有电化学刻蚀法、电沉积法、自组装技术、化学镀层技术等,这些制备方法为快速制备微电极提供了可能性。

1.微电极应用领域

在电化学的研究中常见的电极尺寸是毫米级别,由于其尺寸比较大,限制了其在一些领域的应用。为了满足小空间中如活体、细胞的电化学分析应用需求,微电极应运而生。一般来说,微电极是指至少在一维尺度上不大于25μm的电极[1],其尺寸小于扩散层厚度。目前,微电极是电化学研究中兴起较晚,也正蓬勃发展的一个领域。微电极有利于实现检测装置的集成便携化,同时能够在介电常数较低的有机溶剂中检测电化学活性物质,近年来受到广泛的关注[2]。微电极具有常规电极无法比拟的性质,例如电流密度高[3]、响应快速、iR降小、信噪比高、传质速度快、易达到稳态等,这些优势使其在很多方面的快速、高灵敏检测成为可能。从1960年开始人们发现超微电极具有优良的电化学特性。在神经化学领域研究中,Adams和他的同事研究了一些生物胺类在微电极上的氧化过程及检测方法[4]。在此基础上,Adams[5]将碳糊电极植入到麻醉的鼠脑中,证明了传统的伏安技术能够成功应用到生物组织分析,同样证明神经递质能够从突触间隙的空间扩散到电极表面。与此同时,Wightman等[6]发现微电极在伏安技术方面具有比常规电极更为优越的某些特性,展示了微电极在电化学及电分析化学领域中具有良好的应用前景,从而引起了有关研究人员的广泛兴趣。目前,微电极的研究成为电化学的前沿领域,为研究者们探索物质的微观结构、电化学性质和电化学过程提供了一种强有力的手段,并在生命环境分析领域具有重要应用。制备微电极的方法多种多样,有电沉积法[7]、电化学刻蚀法[8]、激光拉制法和内部填充法等。近年来,随着科学技术的发展,在制备微电极方法上涌现出很多新的技术,如自组装技术[3]、化学气相沉积、模板法、离子束刻蚀技术[3]、丝网印刷术[9]、紫外光照射化学镀层技术[10]等,这些制备方法为快速、高效制备微电极提供了新的思路。微电极在生命分析领域中的细胞检测、活体生物原位分析等方面具有广泛应用[11~14]。在微电极表面进行修饰之后可以用来实现高选择性和高灵敏检测细胞和活体中神经递质类物质的含量以及体内一些关键信号分子,如NO,CO等[15]。微电极还可以应用在毛细管电泳⁃电化学检测系统[16],作为扫描离子电导显微镜和扫描电化学显微镜的探针[17,18],研究电化学反应的动力学参数[19,20],环境分析中检测水中重金属离子[21],检验食品新鲜程度[22]和电位型活体细胞传感等方面[23~26]。总之,微电极可以广泛应用于活体分析、生物传感、生物细胞检测、扫描探针显微镜领域、毛细管电泳⁃电化学检测系统、生命科学、食品学和环境分析与监测等各个领域。

2.微电极的特点

由于微电极的电极尺寸达到微米级,因此具有常规电极无法比拟的电极特性。

电流密度高

在一定电压下,微电极能够产生电化学响应信号。半径很小的电极以非线性扩散中的径向扩散为主,由于电极尺寸小,所得扩散电流在短时间内即能达到稳态[27]。研究结果表明当电流达到稳态时,电流的密度与电极半径成反比,因此,微电极具有很高的电流密度[7]。

iR降小

在电解池中存在电极自身的电阻和电极表面附近溶液层的电阻,从而会产生iR降。而在微电极上产生的极化电流数量级一般在10次方A左右,甚至可达到1012次方A,因此iR降小。

信噪比高充电电流ic与时间t的关系如下式表示:

Q7.jpg

式中,ΔE为阶跃电位的幅度,R为电解池内阻,t为阶跃电位持续时间,C为双电层电容[28]。电极/溶液界面的电容C∝r20,而溶液的阻抗R∝1/r0,因此,时间常数RC∝r0。r0减小使微电极的时间常数RC降低,充电电流ic的衰减速率变得更快,因而增加信噪比,可提高测定的灵敏度。相比之下,常规电极的尺寸大,导致信噪比降低,并不适合于快速的电化学反应研究[29]。

传质速度快且易达到稳态

超微圆盘电极的扩散传质速率M可以用式2[30]表示:

Q8.jpg

D为扩散系数,r为电极半径。r越小,扩散速率越快。与此同时,当电极表面传质速率快时,反应物向电极表面传输的过程中不受干扰。因此,可使用微电极研究速率较快的电化学反应[28]。基于上述微电极传质规律可得到微电极的稳态扩散电流,公式如下:

Q9.jpg

式中,电流为稳态电流,与氧化态物质在溶液中的浓度(cox),扩散系数(D),电极半径(r0)有关[28]。另外,微电极的循环伏安图呈现典型的S形,而不出现常规电极所形成的峰形。

简化测量装置

在常规电极的伏安实验中,为了达到体系的稳定,常采用三电极体系进行测量。而在微电极的体系中,对电极比微电极的面积大104~105倍,对电极上电流密度极低、基本不发生极化,因此,参比电极可同时作为对电极来使用,即在微电极体系中采用二电极体系,从而简化实验装置。

存在的不足

因为微电极尺寸小,所以制备难度大,成本较高,成功率和重现性也是一大难题。通过微电极的电流很小,电流大小达到nA甚至pA级别,所以检测系统应具有更高的信号检测灵敏度。另一方面,由于微电极体系电流信号小,受到环境干扰大,因此,对实验条件的要求比常规电极体系高。目前,加工技术越来越精细,电子技术也有所提高,针对以上这些问题,得到了较好的解决策略。

3.微电极的类别与制备方法

 

按照不同的电极制作材料,伏安法或者安培法用的微电极主要分为非金属微电极和贵金属微电极两类。非金属微电极中多以碳超微电极、碳纤维微电极[5]和碳纳米管功能化微电极为主;在贵金属微电极中,铂微电极和金微电极[29]最为广泛。最常用的电极材料中,碳纤维微电极电势窗口宽,多应用于水溶液体系的电分析。与贵金属微电极相比,碳纤维微电极双电层电容大、背景电流高,因而在检测中信噪比较低[31,32]。根据微电极的形状特点,微电极包含微盘电极、微圆盘电极和微环电极等[29]。按照电极的尺寸大小,可将电极分为微电极(100nm~25μm)[1]、超微电极(100nm~1μm)和纳米电极(<100nm)[33]。

微电极具有诸多优异性能,越来越多的研究者对微电极产生了浓厚的兴趣。制备微电极的传统方法中多以电沉积法[7]和电化学刻蚀法[8]为主。电沉积法即为在基底上沉积电极材料或包覆层[7]。通过电沉积法制备微电极的几何形态主要呈现圆锥形、半球形、球形。最近,Zhang等[34]基于电沉积法制备不同金属材料的电极,如金、铂、银和铜微电极,其电极尺寸小于100nm,对比之前的制备方法,利用该制备方法可控制电极尺寸大小。电化学刻蚀法多以制备半球型微电极为主,如Penner小组[8]使用电化学刻蚀法制备尖端尺寸为1nm左右的电极。具体操作过程如下:首先,在一定的电位下将放置在溶液中的金属丝进行电化学刻蚀之后,可得到锥形的纳米尖端。尖端表面填涂电泳漆、熔融玻璃、环氧AB胶等绝缘物质之后,即可制备出半球型微电极。电化学刻蚀法成本低、仪器简单、重现性好,经过多次绝缘之后方可得到尺寸更小的微电极,因此制备过程较为繁琐。目前,还有一些制备微电极的技术,如自组装技术、离子束刻蚀技术[3]、丝网印刷术[9]、化学镀层技术[10]等,这些都是快速制备微电极的方法

碳超微电极

在非金属微电极中,碳超微电极由于其尺寸易于调控,应用广泛,因而引起有关研究人员的广泛兴趣。Unwin课题组[18]将石英毛细管拉制呈尖锐的纳米尖端,外壁热解丁烷沉积碳形成柱状电极,其电极尺寸易于调控。该方法简单、快速,得到的电极尺寸相对较小且灵敏度高,可应用于扫描电化学显微镜的探针。随后,该课题组[35]制备了一种半径在5~200nm的圆盘状碳纳米电极。将石英毛细管拉制呈尖锐的纳米尖端,使用从上至下的方法制备碳纳米电极,在其尖端高温热解后沉积碳,制成内径在5~200nm的碳超微圆盘电极,这种电极由于尺寸易于调控,可用于单细胞检测。在此电极上沉积铂后可用来监控脑片外部和内部中的耗氧量。另外,这些纳米电极可以作为扫描离子电导显微镜的探针[17],使得活细胞中的成像具有很高的分辨率。

此文献课题组[36]通过将中空的多根石英毛细管缠绕拉制形成微电极阵列支撑体,然后通过热裂解乙炔将碳沉积于石英管内壁形成碳的微环状电极,构筑了尖端为10~50μm、数目可达15个微电极的阵列,应用一个含有8个微电极的微电极阵列可进行单个嗜铬细胞瘤细胞胞吐过程中不同位点释放的电化学成像研究,初步检测到亚细胞层次的胞吐空间分布不均匀性。这一方法为单个可寻址微电极阵列的制备提供了一个全新的思路,为高通量活体分析奠定了坚实的平台基础。

碳纳米管微电极

碳纳米管微电极具有高机械强度、高长径比、良好的导电性等特点使得碳纳米管已经广泛应用到不同的电化学检测中[37,38]。研究表明[39],碳纳米管修饰碳纤维微电极用于神经递质检测时,该电极上电子转移的动力学得到提高并且对有吸附作用的物质的灵敏度有所提高(如多巴胺),而且电极不易受普通生物物质的影响,例如5⁃羟吲哚乙酸。此外,将碳纳米管固定在碳纤维微电极上,并将此电极浸泡在碳纳米管⁃全氟磺酸的悬浮液中首次制备出了碳纳米管微电极[39]。不过,此方法重现性较低。进一步的工作证明单壁碳纳米管化学自组装是在碳纤维圆盘电极上形成均匀排列的碳纳米管层的一种有效方法[40]。体内和体外的实验证明碳纳米管修饰的电极检测多巴胺时灵敏度可提高36倍。

碳纤维微电极

碳纤维微电极的传统制备方法是将碳纤维插入到绝缘性能良好的玻璃或者石英毛细管内,高温拉制成两个具有尖端的电极,利用环氧液滴对尖端进行密封,并暴露出尖端碳纤维,对尾端碳纤维用导线连通,即可成功制备。该微电极直径(100~600μm)较小。因此,它在植入过程中对组织损伤很小,使其得到广泛的应用[5]。Tian课题组[32]第一次在碳纤维微电极上电沉积金纳米粒子进而检测超氧根离子,该检测方法具有一定的选择性、灵敏性和稳定性。另外,由于碳纤维微电极的生物相容性好有利于增强活体中超氧根离子的响应信号。Mao课题组[41]制备碳纤维微电极在活体中选择性检测氧气,在碳纤维表面高温热解酞菁铁然后电沉积上铂纳米粒子,此电极展现出快速的动力学过程,氧气通过四电子转移过程发生还原反应而不形成过氧化氢。这项研究提供一种新颖、可靠的制备方法,用于高灵敏、高选择性地监控在不同生理过程中体内的氧气含量,微电极可用于活体测定氧气含量。

铂微电极

在贵金属微电极中,常使用到的是铂微电极或者金微电极。Bard小组[42]已经运用电沉积法制备Hg/Pt半球电极。Chen等[43]通过电沉积方式使得金纳米粒子整齐地包被在铂盘表面,进而制备出铂微电极,从而实现纹状体中多巴胺含量的检测,响应时间短(<2s),灵敏度提高了2�6倍。Zhang等[44]将直径为25μm的铂线通过拉制、密封、刻蚀等操作成功制备了铂微圆盘电极。另外,该课题组[45]还

在较低的阳极电位下,快速地制备出覆盖有薄层氧化铂的微电极。Umeda等[46]将直径为50μm的铂线进行高温热封、抛光和覆盖一层全氟磺酸膜操作之后,制备出铂微圆盘电极用于检测氧还原反应(ORR)中产生的过氧化氢总量。Lee课题组[15]将铂线热封在已经拉制好的玻璃毛细管里,在氯化钙溶液里进行刻蚀操作,之后电沉积上铂黑形成铂微圆盘电极用于检测一氧化氮含量。因此,将铂丝进行拉制、密封、刻蚀、修饰等操作之后,铂微电极即可制备而成。

金微电极

图1金环微电极的制作步骤

图1金环微电极的制作步骤[12]。(A)拉制好的空玻璃毛细管;(B)毛细管内壁羟基化;(C)毛细管内壁自组装上聚多巴胺层;(D)内壁生长金纳米粒子;(E)形成金膜;(F)金环微电极尖端修饰3⁃巯基丙酸

图2在聚苯乙烯薄片上制备电极的步骤图解

图2在聚苯乙烯薄片上制备电极的步骤图解[10]。(a)紫外照射;(b)氨基;(c)金纳米粒子;(d)金层

金微电极的制备主要是通过在绝缘条件下埋藏一根金导线,并用绝缘材料密封。随后通过电化学的刻蚀[47]、抛光[48]、激光拉制[49]的方法制备成微米大小的微电极。Mirkin课题组[49]通过激光拉制器减小电极尺寸,他们制备的金微电极直径为40nm。到目前为止,涌现出许多制备金微电极的方法,主要包括电沉积法、自组装技术和化学镀层技术。 DiLorenzo[50]报道了一种快速、简单、高效的电沉积方法制备金微电极,即在0.1MHAuCl4和1MNH4Cl溶液中使用简单的电沉积方法,将该电极用于葡萄糖的检测。Bard等[20]报道了基于金纳米颗粒的自组装功能(金纳米颗粒通过二硫键实现自组装),通过自组装技术成功制备金球形电极。其制备过程简单,首先向拉制好的毛细管尖端空腔内注入1,9-壬二硫醇,然后把尖端浸入金纳米颗粒溶胶中,最后调节毛细管尖端大小,即可得到直径为1~30μm的球形电极。该方法反应温和且成本低廉。

该文献课题组[12]采用无毒聚多巴胺多功能材料代替常用的(3⁃氨基丙基)⁃三乙氧基硅烷,发展了一种新颖、简便、快速的化学镀层技术自下而上制备金环微电极的方法。如图1所示,此金环微电极制备过程为在毛细管内壁羟基化,毛细管内壁自组装上聚多巴胺层,盐酸羟胺还原氯金酸形成金纳米粒子,促使金纳米粒子生长并形成金膜。最终制备而得的金环微电极顶端最小直径达到10μm,可控制的金膜厚度达到200nm~3μm。通过金纳米粒子与巯基的自组装可实现对活体中多巴胺的检测。

He等[10]提出一种制备金微电极的化学镀层方法,主要是通过紫外照射的方法使得在聚苯乙烯板上沉积金纳米粒子从而形成金微电极。如图2所示,从低压力汞灯发射的高能量的紫外光照在聚苯乙烯的表面上,使得在照射条件下产生光化学催化的羧基官能团进而与金纳米粒子结合,最终通过化学镀层技术形成金膜。通过在聚苯乙烯上形成金微膜,能够准确控制电极尺寸,制造成本低廉。该电极具有良好的稳定性和优良的电化学性能,他们将此电极应用于多巴胺和儿茶酚胺含量的检测和分离。

在多样化微电极发展的基础上,微电极阵列由于具有高时空分辨率,可以在同一时间从微小的空间如组织和细胞上记录到更多的化学物质代谢变化过程,也引起研究者广泛关注[4]。通过单独控制每个电极的电位可以同时检测到不同的分析物,或者可以记录到单个细胞表面不同空间位点同一化学物质的释放。

捕捉亚细胞水平的细胞胞吐的变化时,微电极阵列测量尺寸和电极间距必须小于细胞(一个神经元直径约为4~120μm)直径大小。通过将碳纤维插入到多管玻璃中制备出碳圆盘微电极阵列和在石英毛细管内热解乙炔沉积碳,可分别形成7和15个碳环微电极阵列[36,51],用于检测单细胞释放的物质。研究人员还利用各种微制作的方法来制备可增加电极数量的微电极阵列。此类微电极阵列可应用在单细胞和细胞网络中[52,53]。Wang课题组[52]报道了一种制备单个可寻址微电极阵列的方法,可用来检测单个嗜铬细胞瘤细胞释放的神经递质物质。他们发展了一种在铂微电极阵列上修饰Ⅳ型胶原的方法,可以促进细胞黏附和生长。他们设计的新装置包含36个微电极,微孔大小为40μm×40μm,此装置可直接将体外培养的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞定位在传感器的正上方。McCarty等[54]在三个凹槽里通过裂解、光刻等技术制备微电极阵列,制备方法重现性好,稳定性良好,该课题组将微电极阵列简单地移植到体内中可实时记录纹状体中多巴胺的释放信号。该课题组[55]还报道了碳超微电极阵列的制备方法。装置包括4~16个通过热解光致抗蚀剂制备而来的微电极,此装置易受光刻控制,并且已经在性能方面类似于玻碳电极。Cai课题组[56]构筑了一种高灵敏的微电极阵列,并在微电极阵列上电沉积聚吡咯石墨烯,用于检测嗜铬细胞瘤细胞释放的多巴胺含量。该检测方法具有高灵敏性、特异性良好、检出限低和响应快速等特点。

文献来源:http://www.progchem.ac.Cn化学进展,2017,29(10):1173~1183DOI:10.7536/PC170620

作者:赵旭†王克青†李博李长青林雨青∗∗

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