微流控技术在精子优选中的应用-汶颢股份
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微流控技术在精子优选中的应用

传统精子优选方法包括上游法、密度梯度离心法,主要根据沉降和迁移速度选择活力和形态正常的精子,与体内重重筛选机制相差较大,且分选时间过长、离心操作过多易导致精子DNA过氧化损伤和断裂,精子质量降低,影响ART成功率。因此,建立简单、快速、无/低损伤的精子优选新方法已成为提高辅助生殖技术(ART)成功率的迫切需求。微流控技术的应用正适应了这一需求,稳定的流体环境可最大程度地避免精子机械损伤。

精子优选

临床上精子优选主要依赖于精子活力和形态两项指标。目前微流控技术进行精子活力评价与筛选的方法有微通道筛选、介电电泳力筛选及层流效应筛选。

微通道筛选是通过形成稳定流体,使精子在流体中自由游动,不涉及过多的人为操作,故非常直接且减少/避免DNA机械损伤。

国外团队曾设计单一直通道、分枝级联通道、存在障碍物的通道等系列芯片对人精子计数及活力测定。结果显示,精子朝一个方向游动且能穿越宽40、100、120 um的单一直通道,高活力精子能穿越较长通道,精子亦可通过分枝级联的弯曲通道。同时他们进行了精子功能测定,如穿透宫颈粘液,与透明质酸、杀精剂和抗人IgG抗体的作用等,证明微流控技术评价精子功能的有效性和多面性。他们通过改进芯片结构,进样池经2条或4条弯曲通道与收集池连接,通过精子到达收集池的时间判断精子活性,实现分级评价。该方法与 Makler 计数板依据精子前向运动分级评价结果相关性良好,高活力精子( 3 级、3+级)至收集池耗时360~ 480 s,低活力精子( 1级、1+级、2级) 耗时660~770 s。该实验以精子评价为主,不以精子筛选为目的。

McCormack等设计直通道利用荧光标记技术进行精液样本受精能力筛查实验。参照WHO标准,活力精子浓度、前向运动精子浓度筛查实验结果显示,该系统荧光信号与二者浓度皮尔逊相关系数分别是0.79、0.80,灵敏度分别是94%、96%,特异性分别是97%、90%,但该装置价格昂贵且荧光标记复杂,限制其广泛应用。

Seo等依据精子逆流游动的特性优选公牛、小鼠、人精子。实验时通道A、B、C内流体分别流向交叉点、储液池2、储液池3,储液池2通入精液样本,活力精子逆流穿越通道B到达交叉点,再被高速流体输送到储液池3,实现精子优选。特别是该法分选3份公牛精子,精子活力由平均18.4%提高到78.8%。依据相同原理,Chen等设计一款便携型精子质量分析仪,该系统集成库尔特技术进行精子计数,评价精子活力及浓度两项指标。实验证明电压脉冲数 0~335分别对应临床用血球计0~19*10^6/ml、精子质量分析仪精子活力指数0~204。本系统无需荧光标记、成本低、操作方便,且无需样本预处理,但计数孔尺寸较小 (宽6 um)。

微流控技术在精子优选中的应用

微流控技术在精子优选中的应用

Han等设计阵列微坝连接两微室简易结构实现活力精子筛选,且集成稳定可靠的控温模块。结果显示该系统较培养箱及室温更适合精子,同时该系统集成倒置光学显微镜可用于精子评价、胚胎培养及体外受精(IVF)研究。

运动速度最快的精子未必是受精能力最强的精子,故精子分级捕获及评价有利于男性不育症的诊断及精子生理特性研究。Qiu 等设计不同通道截面实现各区段流速不同,在各流速区段分别捕获与其相匹配的活力精子,统计各区段精子数目得到各级活力精子百分率。作者分别捕获了平均直线速度( 40.5±3.0)、( 27.2±0.6) 、( 18.7±0.6) μm / s的活力精子。

直通道筛选精子简单方便,且与生理环境接近,但目前尚无公认的尺寸标准。谢兰以出口池精子相对数量和精子活力作为评价标准,通过荧光标记精子验证直通道筛选效果。宽度筛选通道:长7mm,深25μm,宽200μm、500μm、1mm及1. 5mm;长度筛选通道:宽1mm,深25μm,长5mm、7mm、1cm及1. 5cm;获得最佳通道宽度和长度,优化通道深度: 深25μm、50μm、100μm及200μm;获得最佳通道宽、长、深,优化筛选时间5 min、15 min、30 min及60 min。当宽1 mm、长7 mm、深25μm的直通道,经15 min筛选的ICR小鼠精子不仅活力更高 ( 82.6±2.9 ) %且互相分散,有助于提高IVF的成功率。

微通道筛选只是单纯依据精子的游动优选精子,不能完全反映生理状态下精子的自然优选过程。钟志敏等在芯片上模拟生理状态下精子与宫颈粘液相互作用,实现精子的自然优选和精子质量在线检测。本方法用时短、无需离心,且优选的精子在精子活力、平均轨迹速度、前向性比例、正常形态百分率等指标均优于分选前及上游法,同时也为芯片上模拟生理状态下的受精过程奠定基础。

微通道筛选精子简单易用,与生理环境接近,且对精子的伤害小,故其临床应用前景非常广泛,同时活力筛选通道也有集成后续受精相关器件的潜力,为在芯片上实现IVF的全过程奠定基础。

介电电泳技术(dielectrophoresis,DEP)是指细胞在不均一交变的电场中被诱导极化,不同的细胞由于介电特性、电导率、形状或大小等不同而感应出不同的偶极矩,因此在电场中受到不同的介电力而得以分离。

Fuhr等通过施加不同高频电场实现不同活性的人单精子捕获、定位和筛选。在石英和玻璃基 质上制作超微电极,当外界盐溶液的电导率大于精 子的平均电导率时,负向介电电泳作用形成,精子由电极处被推向电场最小处。在平面4电极或三维8电极区域施加高频交流电,形成向心推斥力,快速游动的精子可以被捕获数秒 (电场>500V / cm、频率MHz时,部分精子停止运动)以便监测;采用条状电极及叉指电极,速度约40~70μm / s的精子将被固定在断点电极处数分钟。该系统亦可以将捕获的幸存精子释放至特定区域以便集成后续实验操作。

当通道尺度进入微米量级、流体雷诺数低时,相互靠近且平行的两股层流仅靠扩散作用实现混合。层流稳定后,在表面张力和粘滞力的作用下使活力精子从原液中穿过层流界面游至收集通道中,无活力精子及细胞碎片保留在原液中流动直至排出,从而实现精子活力筛选。

Cho 等集成水平式重力驱动微基于层流效应实现人精子筛选,克服使用传统重力微泵时流速随时间不断降低的缺陷。3个样本经筛选后精子活力均接近100% ,精子正常形态率从 ( 9.5±1.1) % 提高到( 22.4±3.3 ) % ,活力精子回收率分别为39%、42%、43%。该系统集成度高、分选效率高,且样品量仅需50μl( 常规精子优选方法难以操作) 。Schuster等从实践上证明了层流效应筛选精子的低损伤功能,但该系统精子回收率并不高,且筛选效率有待进一步提高。同未处理、连续离心法、密度梯度离心法、上游法相比,Schulte等证明了层流效应筛选的精子活力最高 (分别是52.0%、50.1%、73.4%、85.8%、96.2%,P<0.0001),DNA损伤率最低 (分别是13.3%、15.8%、14.9%、5.7%、1.9%,P<0.05)。王维等考察层流原理分选的精子质量,同上游法相比,精子DNA 损伤率明显下降,且活力、正常形态率及尾部肿胀率均有显着提高。后对自行设计的三通道芯片(样品通道居两侧)的通道入口角度及分选通道宽度进行优化。3种通道入口角度 ( 30°、45°、60°) 和3种通道宽度( 120、180、250 μm)的芯片分选的精子活力和正常形态率均无显着差异,但入口角度30°、分选通道宽250 μm时,分选效率最高。

微流控技术在精子优选中的应用

Wu等采用聚乙二醇甲基丙烯酸酯表面改性聚二甲基硅氧烷( Polydimethylsiloxane,PDMS) 精子优选芯片,亲水性长时间( 56 d) 稳定,非特异性吸附极小、有效避免通道堵塞,且通道表面易浸润、利于进样,筛选的人精子活力为74%。

PDMS 因安全无保证、石英因成本高均不适合临床应用,Matsuura等采用临床领域已认可的环烯烃聚合物制作精子筛选芯片,经过筛选,精子活力由53.0%提高到90%,线性速度由废液池的( 21. 0±1.7)μm / s 增大至收集池的( 51.7±2.1)μm / s ( n = 172)、( 59.5±1.6 )μm /s( n = 79 ),且提高了ART成功率,但活动精子回收率较低 ( 0.2%~0.3% )。

Tseng等采用荧光染料SYBR-14 / PI标记人精子,通过注射泵进样,依据层流效应筛选活力精子,并用显微镜观察不同活力的精子,流式细胞仪鉴别及量化死/活精子。该系统流速可控、稳定,且精子筛选效率提高(精子存活率94.8% )。

优化的层流效应精子活力筛选芯片,可有效筛选高活力精子,对于未处理的精液,尤其是含有大量碎片的精液有着极其重要的应用价值。由于此方法不能筛选特定流速的精子,且流速限制不能筛选大量精液,同时目前此方法的应用有限,未见对中重度少弱精液样本的处理效果和在ART中的应用效果的报道。

微流控技术优选精子具有分选效率高、精子DNA损伤少、操作简便且分选时间短的优点,在ART 中无论是IVF 和 ICSI 中精液参数正常还是轻度少弱精子症的精子优选都将具有良好的应用前景。

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