核酸等温扩增技术在微生物快速检测中的研究进展-汶颢股份
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核酸等温扩增技术在微生物快速检测中的研究进展

核酸体外扩增技术在分子生物和生物分析等领 域是一项重要的技术,可用于定性、定量地分析和 检测微量核酸,其在临床医学、检验医学、分子生物学、基因组学及食品安全等相关的各个领域发挥 着重要的作用,是生命科学发展不可或缺的一种重 要检验方法。随着生物技术在临床和现场检测方面 要求的不断提升,越来越多的研究人员开始把目光专注于核酸体外扩增新技术的研究。聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)由于其特异性强,灵敏度高等优点,是目前应用最为广泛的核酸体外扩增技术。

聚合酶链式反应 

聚合酶链式反应

虽然 PCR 技术已经应用于分子生物 学等各个领域,但是该技术需要通过不断的变化温度才能实现核酸扩增,因此,热循环仪是不可或缺 的设备。然而,由于热循环仪体积大、价格较高, 使其在基层的推广和现场检测受到了极大的限制。因此,陆续出现了不同的等温扩增技术,这些技术反应温度单一,不受热循环仪的制约,正逐渐成为 PCR 的最佳替代方法。

20 世纪 90 年代初,很多研究人员看到了突破 传统核酸体外扩增技术将会带来核酸体外扩增的新 革命,从而尝试创新发展无须热变性的核酸恒温扩 增技术,并挖掘其在各领域应用的潜力,这些核酸 等温扩增的新技术应用于生命科学及相关的各个领 域是必然趋势,也吸引了越来越多研究者的目光。

 等温扩增技术的基本原理和反应成分各不相同, 依据等温扩增的基本原理和步骤,本文将现有等温 扩增总结为两大类,第一类是第一步反应依赖于特 异性引物延伸的等温扩增技术 ;第二类是第一步反 应依赖于限制性内切酶的等温扩增技术。本文概述 并比较分析了核酸等温扩增技术的优缺点及反应原 理等,以期对相关领域的研究起到积极的促进作用。 1 依赖于特异性引物延伸的等温扩增技术 与传统 PCR 技术相似,为了保证目的片段特异 性扩增,避免非特异产物的形成,在众多等温扩增 方法中,依然使用特异性引物退火延伸作为等温扩 增的起始步骤,如依赖核酸序列扩增技术、滚环扩 增技术、环介导等温扩增等。但是,由于引物与目 的模板退火结合的机理,这就不可避免地要对非单 链的起始靶物质进行高温变性处理,这些方法并不 是彻底的等温扩增。随着技术的发展,为了避免高 温热变性步骤,DNA 解旋酶、单链结合蛋白等被引 入等温扩增体系。

1 依赖于特异性引物延伸的等温扩增技术

 与传统 PCR 技术相似,为了保证目的片段特异 性扩增,避免非特异产物的形成,在众多等温扩增 方法中,依然使用特异性引物退火延伸作为等温扩 增的起始步骤,如依赖核酸序列扩增技术、滚环扩 增技术、环介导等温扩增等。但是,由于引物与目 的模板退火结合的机理,这就不可避免地要对非单 链的起始靶物质进行高温变性处理,这些方法并不 是彻底的等温扩增。随着技术的发展,为了避免高 温热变性步骤,DNA 解旋酶、单链结合蛋白等被引 入等温扩增体系。

1.1依赖核酸序列扩增技术

依赖核酸序列扩增技术(Nucleic acid sequencebased amplification,NASBA) 于 1991 年 由 Compton 等首次提出,该方法结合了转录依赖扩增系统 (Transcription-based amplification system,TAS)和 自 主 序 列 复 制 系 统(Self-sustained sequence replication,3SR)2 种方法,并对其进行改进。

NASBA 技 术 与 3SR 相 似, 依 赖 AMV 逆 转 录 酶、RNase H 和 T7 RNA 聚合酶和一对引物来完成等 温扩增,整个反应包含非循环相和循环相。在对目 的 RNA 片段进行扩增时,以指数扩增方式大量生成 单链 RNA。不过,与 3SR 相比,NASBA 使用了 DMSO( 二 甲 基 亚 砜,Dimethyl sulfoxide,DMSO), 反应温度也适当地从 37℃提高到 41℃,有效地提 高了反应的特异性。随后,Gene-Probe 公司基于 NASBA 成功研制出依赖转录介导扩增(Transcription mediated amplification,TMA)检测试剂盒,带有 RNase H 活性和逆转录酶活性的 MMLV 逆转录酶(鼠 白血病逆转录酶)取代了 AMV 逆转录酶、RNase H。 由于 3SR,NASBA 和 TMA 的原理十分相似,所以 较多文献将这 3 种技术或其中两种视为同一种。

NASBA 除了应用于 RNA 扩增,经过适当的改 良也可以扩增 DNA:一种方法是使用限制性内 切酶切割双链 DNA,使其末端产生 T7 RNA 聚合酶 启动子序列;另一种方法是在非循环相里进行两 次 95℃变性,第一次变性,双链 DNA 解离成单链 DNA,引物退火结合上后,在 AMV 反转录酶的作用 下,延伸形成新的双链 DNA,接下来进行第二次变 性,从而获得了 5' 端含有 T7 RNA 聚合酶启动子序 列的单链 DNA。

NASBA 由于其快速高效、操作简便、设备要 求低、扩增对象广等特点,已被广泛应用与发展。 Lau 等分别使用 NASBA- 电化学发光法(NASBAECL)和 NASBA- 酶连接寡核苷酸捕获技术(NASBAEOC)两种检测方法检测出口蹄疫病毒 ;Zhao 等 通过微流控芯片实时免疫 NASBA 检测出水传染病原 菌 ;Clancy 等开发出一种带有扩增内标的双重 实时 NASBA 诊断方法,成功检测引起细菌性脑膜 炎的流感嗜血杆菌,脑膜炎奈瑟氏菌和脑炎链球菌。 Hønsvall 等使用实时 NASBA 技术扩增微小隐孢 子虫和人隐孢子虫的 MIC1 转录本,成功区分以上 两种隐孢子虫,在 10 μL 保存悬液中,检测灵敏度 可低至 5 个隐孢子虫卵囊。Zeng 等结合 NASBA 和 ELISA 两种技术优势,开发出 NASBA-ELISA 检 测方法,实现高效简便检测草鱼呼肠孤病毒。尽管 NASBA 存在众多优势,但是其缺点也不能被忽视 : 首先,其不是完全意义上的等温扩增技术,不能进 行一步扩增 ;其次,酶的热稳定性差,不能在反应 之前加入 ;最后,有效扩增片段的长度较短,仅100-250 bp 之间。

1.2 滚环扩增技术

Fire 等 于 1995 年首次提出滚环扩增技术 (Rolling circle amplification,RCA),该技术是借鉴微 生物环状 DNA 复制过程建立起来的一种体外等温扩 增技术。在 RCA 反应中,phi29 DNA 聚合酶是至关 重要的组成部分,具有持续 DNA 合成能力和链置换 活性。RCA 的反应模板通常是单链环状 DNA,因此, 须对双链 DNA 样品进行处理。如果样品是双链环 状 DNA,则变性处理即可 ;但如果样品是双链线状 DNA,在进行变性处理后,还需用 T4 多核苷酸激酶 与 T4 DNA 连接酶环化单链线状 DNA。RCA 按 引物数量可分为单引物 RCA,双引物 RCA 和多引物 RCA。

1.2.1 单引物 RCA 只需要一条引物 P1 即可完成 扩增。引物 P1 与单链环状 DNA 结合后,在 phi29 DNA 聚合酶的作用下开始延伸,当合成至自身 5' 端 时,在 phi29 DNA 聚合酶链置换活性的作用下,5' 端 DNA 开始被置换下来,并继续以环状 DNA 为模 板进行线性合成,最终生成一条具有重复序列且与 模板 DNA 完全互补的线状单链 DNA。

1.2.2 双引物 RCA 也称为超分支滚环扩增,在 单引物 RCA 的基础上,再增加一条与扩增产物互补 的引物 P2,P2 可与单引物 RCA 的产物退火延伸。 随着反应的进行,P2 延伸链开始将下游 P2 的延伸 链置换下来,被置换下来的 P2 延伸链作为模板与 P1 结合。同样地,上游 P1 延伸链会把下游 P1 延伸 链置换下来,如此形成指数扩增,最终得到一系列 长短不一的双链 DNA 产物。

1.2.3 多引物 RCA由 phi29 DNA 聚合酶、单链 环状 DNA 模板和随机引物组成。多引物 RCA 原理 与双引物 RCA 相似,随机引物可以在环状 DNA 的 不同位置同时延伸产生多个复制叉,然后在聚合酶 的作用下置换非模板链,在置换非模板链的同时, 其他随机引物也开始与非模板链退火延伸,进而合 成双链 DNA。与单引物 RCA 和双引物 RCA 相 比,多引物 RCA 在合成速率和产量方面得到了明显 提高。

到目前为止,出现了许多原理与 RCA 相似或衍 生于 RCA 的核酸扩增技术,如利用 T7 RNA 聚合酶 建立的以单链环状 DNA 为模板的滚环扩增技术 ; 用于扩增基因组 DNA 的多重置换扩增技术(Multiple displacement amplification,MDA);利 用 锁 式探针的信号扩增 RCA。在微生物检测方面, Rockett 等开发出依赖特异性引物的 dRCA 技术, 在存在人源 DNA 的情况下,成功特异扩增 BKV, HPyV6,HPyV7,TSPyV 和 STLPyV 等 7 种人多瘤病 毒,相比使用随机引物的传统 RCA 法,dRCA 具有 更强的灵敏度和更高的产量。Wen 等使用 RCA 技术扩增埃博拉病毒基因,同时基于氧化石墨烯吸 附 FAM 的性质,开发出一款新型荧光生物传感器, 成功对扩增产物进行检测,检出限低至 1.4 pM,即 使在 1% 人血清中,也可检测出目的基因。Hao 等 基于 RCA 技术和 WS2 纳米片,发明了一种用于检测 金黄色葡萄球菌的加强化学发光能量共振转移传感 器,其检出限可达 15 CFU/mL。RCA 与其他核酸扩 增方法相比,其主要优点为 :反应机制简单,仅需 一种聚合酶即可实现核酸扩增 ;灵敏度高,一条引 物可达到 105 倍扩增,而两条引物的扩增效率可 达到 109 倍;不需要 PCR 仪,避免了热循环过程 对反应组分的影响。RCA 的不足之处在于 :前期处 理繁琐,反应模板要求是单链环状 DNA,须对不符 合要求的样品进行退火和环化处理 ;反应时间较长, 至少需要 4 h。

1.3 环介导等温扩增

增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是 Notomi 等 于 2000 年开 发的一种具有快速高效、特异性强、录敏度高等特 点的等温扩增技术。LAMP 的反应过程可分为 3 个 阶段 :循环模板合成阶段、循环扩增阶段和伸长再 循环阶段。LAMP 使用 4 条引物,分别是正向 内引物 FIP(包括 F1c 和 F2 两部分序列,其中 c 代 表反向互补序列),反向内引物 BIP(包括 B1c 和 B2),正向外引物 F3 和反向外引物 B3。

反应初始,FIP 和 F3 先后与单链 DNA 模板结 合,引发循环模板合成,随着 F3 的延伸,FIP 产生 的延伸链被置换出来,同时,其 5' 端发生自我碱基 52 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2017,Vol.33,No.7 配对,形成环状结构。随即,BIP 和 B3 以环状结构 DNA 作为模板延伸,引发新一轮链置换反应,最终 形成一条哑铃状单链 DNA,即循环模板。进入循环 扩增阶段后,哑铃状单链 DNA 3' 端以自身为模板 进行延伸,打开 5' 端环状结构,形成一条双链茎环 DNA。随后,FIP 的 F2 区域与茎环 DNA 环状结构 中的 F2c 区域互补配对,发生延伸置换反应,自此 引发循环扩增和伸长再循环扩增,进入指数扩增阶 段。随着 FIP 与 BIP 不断与环状结构结合,链置换 反应持续发生,最终大量生成不同长度地多环花椰 菜结构 DNA,而每条 DNA 则是由交替反向重复靶 序列构成。LAMP 原理虽然复杂,但是实际操 作简单,是一种简单、快速、有效的核酸扩增技术。

LAMP 的主要优点是特异性强,多条互补序列 的引入使得即使存在非目的 DNA 的情况下,也不会 对靶序列的扩增产生明显影响 ;其次,LAMP 扩增 效率高,由于存在多个循环体系,可实现高效扩增, 其检测限可低至几个拷贝,远优于 PCR。再次, LAMP 扩增产物检测方便,LAMP 会产生焦磷酸镁白 色沉淀,通过肉眼或浊度仪即可判定体系是否发生 DNA 扩增,适合用于即时检测(Point-of-care testing, POTC)。在 10 多年的时间里,不断有研究者从模板性质、反应抑制因子、环引物的引入及多 重检测等方面对 LAMP 进行改进。到目前为止, 由于引物设计的复杂性,仅发展到五重检测。由于 LAMP 反应成本低、扩增时间短,无论是实验室研 究还是现场检测都可以准确、快速、灵敏的完成, 所以在基层检验的推广中具有良好的前景,是真正 普及型的核酸检测方法。科学家们已经将 LAMP 技 术成功应用于病毒、致病菌及转基因作物的检测。尽管 LAMP 扩增技术应用十分广泛,但是不 可避免的,LAMP 也存在一定的缺陷 :首先,由于 LAMP 产物鉴定结果只有扩增与不扩增,所以如果 发生非特异性扩增,则不易识别。其次,其基本原 理是基于链置换和链取代两种过程,LAMP 的扩增 片段长度一般在 200-300 bp,限制了 LAMP 在扩增 长片段方面的应用。另外,由于高灵敏度,操作过 程中极易发生污染从而产生假阳性结果 ;LAMP 在 产物的回收、鉴定、克隆和单链分离等方面也存在 很大的操作障碍。 1.4 依赖解旋酶扩增技术 DNA 体内复制主要依赖于 DNA 解旋酶、DNA 聚合酶以及各种辅助因子,根据以上复制机制, Vincent 等模拟出依赖解旋酶扩增技术(Helicasedependent amplification,HDA)。HDA 是 一 种 彻 底 的等温 DNA 体外扩增技术,目前,能够达到反应 全过程恒温这一条件的体外等温扩增技术屈指可 数,其全程等温的实现主要依赖于大肠杆菌 UvrD 解 旋酶。

HDA 的原理分为两个阶段 :第一阶段,核酸解 旋酶打开 DNA 双链,使目的模板链解链为单链状态; 单链结合蛋白与之结合,它的作用是保证单链结构 不发生复性 ;第二阶段,DNA 聚合酶各自以单链为 模板由引物为起始生成新链,新生成的双链 DNA 作为下一轮扩增的模板,如此反复循环扩增实现靶 DNA 量的指数增加。HDA 的反应步骤与 PCR 相似, 均包括双链 DNA 解链、退火及延伸等步骤,但最大 的区别是采用酶维持单链作用替代升温解双链过程。 HDA 的出现引起了许多研究者的关注,并对 其进行了大量的研究及改进。An 等报道了嗜热 HDA(Thermophilic helicase-dependent amplification, tHDA),该技术将原先使用的大肠杆菌 UvrD 换成了 来自腾冲嗜热杆菌 Thermoanaerobacter tengcongensis 的耐热 UvrD 解旋酶(Tte-UvrD)。该酶的应用使反 应可在 60-65℃之间进行,温度的提升增强了该技 术的灵敏度和特异性。Li 等 在未提取 DNA 的 前提下,直接使用 tHDA 成功检测出人体血液中的 疟原虫,检出限达到 50 拷贝。Motré 等研发出 了一种具有两种不同功能的新酶,既可以解旋双链 DNA,又可以进行聚合反应,解决了解旋酶与聚合 酶协作效率低的问题。这种酶实质上是 Tte-UvrD 和 Bst DNA 聚合酶通过卷曲螺旋域连接在一起的复合 体。该新酶的使用明显提高了扩增片段的长度。除 了 前 面 提 到 的 两 种 发 展 外,Xu 等 的 cHDA 和 Goldmeyer 等的 RT-tHDA 也对传统 HDA 进行了 改良。

HDA 作为新型等温核酸扩增技术的优势在于 : 反应全程温度恒定,无需调节温度,克服了传统 2017,33(7) 王大洲等 :核酸等温扩增技术在微生物快速检测中的研究进展 53 PCR 通过“变性 - 退火 - 延伸”过程的多次变温循 环的瓶颈 ;反应机制简单,仅需两条简单的引物 ; 反应时间较短,在 1-1.5 h 就可以实现扩增。然而 HDA 也存在其缺陷,目前,常用的解旋酶是大肠杆 菌 MvrD 解旋酶,其解链速度为 20 bp/s,解旋速度 慢及持续能力差,因此 HDA 只适用于扩增短片段。

1.5 重组酶聚合酶扩增

HDA 之 后,Piepenburg 等 于 2006 年 创 建了一种新型的全程等温扩增技术,其与 HDA 相 似,也使用酶来打开双链 DNA,该技术称为重组酶 聚 合 酶 扩 增(Recombinase polymerase amplification, RPA)。RPA 是参照了 T4 噬菌体 DNA 复制系统,该 反应系统中除了需要一种常温下能工作的 DNA 聚合 酶外,还包含噬菌体 μvsX 重组酶和单链 DNA 结合 酶 gp32,目前有些实验中还会加入辅助 μvsX 重组 酶的 μvsY 蛋白。重 组 酶 介 导 等 温 扩 增(Recombinase aid amplification,RAA) 是 基 于 RPA 的 一 种 改 良, 最 大的突破是重组酶的选择上。RPA 使用的是噬菌 体 μvsX 重组酶,而 RAA 使用的是从细菌或真菌中 获得的重组酶。这类酶不仅来源更为广泛,而且最 重要的是它在 37℃恒温下便可与引物紧密结合形成 酶 - 引物聚合体,反应的温度适应性更强。

两种方法的扩增原理为 :引物常温条件下与重 组酶结合形成一种结构稳定的复合物,当引物在模 DNA 上搜索到与之完全互补的序列时发生退火 ; 退火发生的同时单链 DNA 结合蛋白被激发,发生 作用使模板 DNA 保持单链状态,引物在 DNA 聚合 酶催化作用下延伸形成新的 DNA 互补链。RAA 和 RPA 反应迅速快捷,通常在 1 h 内即能得到可以用 琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增产量。

HDA 相 同, 用 于 检 测 PCR 产 物 的 方 法 也 可用于 RPA。Piepenburg 等设计了含有一个四氢呋 喃(Tetrahydrofuran,THF)分子的荧光探针,并在 THF 两侧的核苷酸上分别标记一个报告荧光基团和 一个淬灭荧光基团。同时,为了防止探针被作为引 物延伸,对其 3' 端进行修饰。当探针结合到模板 上时,来自大肠杆菌的核酸内切酶 IV(Nfo)识别 切割 THF,上游探针形成新的 3' 端,在 Bsu 聚合 酶的作用下,作为引物延伸,置换出下游探针,从 而使两个荧光基团分离,产生荧光信号。为了实现 无需实验室的即时检测,Piepenburg 等还设计了用 于侧向流试纸条检测的探针。该探针与荧光探针相 似,其正向引物标记羧基荧光素(Carboxyfluorescein, FAM),反向引物标记生物素,因此,在 Nfo 和 Bsu 聚合酶的作用下,最终生成带有双标记的扩增产物。 在试纸条上,扩增产物先与带有 FAM 抗体的胶体金 结合,再在检测线上被生物素抗体捕捉,使检测线 显色,达到检测目的。目前,英国公司 TwistDX Inc 基于以上两种探针,已分别开发出 TwistAmp® exo 试 剂盒和 TwistAmp® nfo 试剂盒。TwistAmp® exo 试剂盒 是用于荧光检测,不过将 Nfo 替换成了核酸外切酶 III(exo),而 TwistAmp® nfo 试剂盒是用于试纸条检测。 目前,RPA 已经可以替代传统 PCR 实现检测,特别 是在病毒检测方面颇具竞争力,如裂谷热病毒, 检出限达到 19 个拷贝 ;艰难梭状芽孢杆菌,检 出限为 1 000 个 DNA 拷贝,相当于 1fg DNA ;布鲁 氏菌,检出限可低至 3 个拷贝。

RPA 其优点在于 :反应全程等温进行,不需热 变性 ;引物设计简单 ;灵敏度高,最低能检测出仅 含一个拷贝的样品 ;特异性强,可进行多重 RPA。 RPA 的主要缺点:由于引物(30-35 nt)与探针(46-54 nt)较长,不适合较短靶序列的检测;RPA 反应 条件较苛刻,不适合直接扩增粗样品。

1.6 信号介导RNA扩增技术

Wharam 等于 2001 年创建了信号介导 RNA 扩 增 技 术(Signal-mediated amplification of RNA technology,SMART)。SMART 与 NASBA 一 样, 是 一种依赖 RNA 转录的等温扩增技术。但是,SMART 不是通过增加靶序列拷贝数实现检测,而是通过信 号的放大来进行。

SMART 体系含有两条探针,分别是延伸探针 和模板探针。两条探针均有一个区域可分别与靶序 列互补结合,同时还含有另一个可相互互补结合的 区域,从而两条探针与靶序列形成 SMART 反应中 关键的三通结构(Three-way junction,3WJ)。延伸 探针在 Bst DNA 聚合酶的作用下,以模板探针为模 板,形成双链 T7 RNA 聚合酶启动子和双链转录模 54 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2017,Vol.33,No.7 板。双链启动子激活 T7 RNA 聚合酶不断对转录模 板进行转录,线性合成 RNA 信号。为了获得更佳的 检测灵敏度,可进一步扩增 RNA 信号,将已生成 的 RNA 信号与另一条探针结合,该探针结构与模 板探针结构相似,也有 T7 RNA 聚合酶启动子以及 转录模板。后续的扩增过程与先前的扩增相同,双 链 T7 RNA 聚合酶启动子和双链转录模板生成,T7 RNA 聚合酶不断对转录模板进行转录,线性合成 新的 RNA 信号。RNA 信号用酶联寡核苷酸吸附实 验(Enzyme-linked oligosorbent assay,ELOSA)进行 检测。

SMART 是一种特殊的等温扩增技术,通过扩增 信号来检测靶序列。Wharam 等使用 SMART 成功检 测大肠杆菌基因组 DNA 和总 RNA 中的特异性序列, 甚至不需要提取核酸,直接进行检测。Hall 等 选用 g20 基因,使用 SMART 成功区分海洋噬藻体 的两个种——S-PM2 和 S-BnM1,证明 SMART 可直 接检测粗样品。Murakami 等首次将 3WJ 结构与 PG-RCA 联合使用,成功检测人 CD4mRNA,其中 PG-RCA 起着信号放大的作用 ;周敏等使用相同 的方法也成功检测到肠道病毒 71 型,其检测限低至 埃摩尔级,灵敏度极强。经实验验证,SMART 的主 要优点为 :检测范围广,既可检测 DNA,也可检测 RNA ;探针设计简单,只需设计与靶序列结合的区 域,其它的都是通用序列区域 ;特异性强,只有形 成 3WJ 结构,RNA 信号才能生成 ;可直接检测粗提 样品。由于 SMART 还存在较多的不足,如反应 时间长、靶序列须是单链核酸片段、操作繁杂、灵 敏度较低等,目前相关的应用报道还较少。SMART 在接下里的发展中,应该专注于提高检测灵敏度, 发展比 ELOSA 更高效的检测方法,以及将扩增与检 测集中于一个试管中。

1.7 单引物等温扩增

单引物等温扩增技术(Single primer isothermal amplification,SPIA) 由 Kurn 等[56] 于 2005 年 首 次 报道。该技术主要通过使用一条嵌合引物“5'-RNADNA-3'”、RNase H 和具有强链置换活性的 DNA 聚合 酶来实现核酸等温扩增。

反应初期,嵌合引物与单链 DNA 模板互补结 合,在 DNA 聚合酶的聚合作用下开始延伸。同时, RNase H 降解嵌合引物与模板形成的杂合链 DNA : RNA 中的 RNA 链,使未结合引物 RNA 部分与模 板结合,在 DNA 聚合酶的链置换活性下,新引物置 换旧引物的延伸产物,并开始延伸。与此同时,新 引物与模板形成的杂合链中的 RNA 链再次被 RNase H 降解,如此循环,进行线性扩增,从而产生大量 与单链 DNA 模板互补的单链 DNA 产物。若想限制 产物的长度,可使用链终止多聚核苷酸(Blocker)。 Blocker 能 与 单 链 DNA 模 板 结 合, 当 引 物 延 伸 至 blocker 时,将停止延伸,这是因为 blocker 中的部分 碱基已被修饰,其与模板的结合力大大增强,DNA 聚合酶无法置换出 blocker。为防止 blocker 发生延 伸反应,其 3' 端也需要进行修饰。在 SPIA 的 基础上,通过添加逆转录酶,可实现以 RNA 为模板 扩增 DNA,该技术被称为 Ribo-SPIA,其检出限为 1 ng RNA,且具有很好的重复性。

SPIA 的主要优点在于 :使用单引物,减少了 引物二聚体的形成 ;不受 RNA 干扰 ;反应机制简 单,效率高。目前,其已被用于基于表达分析以及 病原菌检测,同时证明该技术在检测沙门氏菌 方面比 qPCR(quantitative PCR,qPCR)具有更好的 灵敏度和特异性。但是,SPIA 也存在其缺点 :模板 是单链核酸,需对双链核酸进行热变性处理 ;需对 blocker 进行碱基修饰,提高扩增成本 ;引物是嵌合 引物,设计较复杂。

1.8 嵌合引物引发的核酸等温扩增

嵌合引物引发的核酸等温扩增技术(Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids,ICAN)与 SPIA 相 似, 均 主 要 依 靠 嵌 合引物、RNase H 和具有强链置换活性的 DNA 聚 合 酶, 不 过 ICAN 需 要 一 对 引 物, 同 时 引 物 中 的 DNA 与 RNA 序列排布位置与 SPIA 的引物相反,是 “5'-DNA-RNA-3'”构型。ICAN 的扩增产量高度依赖 引物浓度,随着浓度的增高,产量显著提升。

重复“nick-and-run”是 Mukai 等对 ICAN 扩 增机制提出的第一个假设。一条引物与模板结合后, 在 DNA 聚合酶的作用下开始延伸。随即,RNase H 切割引物 RNA 部分与引物延伸产物之间的结合点, 2017,33(7) 王大洲等 :核酸等温扩增技术在微生物快速检测中的研究进展 55 形成缺口。DNA 聚合酶再次作用于 RNA 3' 端,在 置换出下游 DNA 的同时,引物开始重新延伸,结合 点再次形成。RNase H 再次切割结合点,在 DNA 聚 合酶的作用下,引物继续重新延伸,进入循环扩增。 得到的单链 DNA 则作为另一条引物的模板进行扩 增,原理相同。依照重复“nick-and-run”扩增机制, 扩增产物中不应含有 RNA 残基,然而经序列分析, 发现扩增产物中存在着大量带有 RNA 残基的产物。 因此,Uemori 等认为 ICAN 还存在着其它反应 机制,他们分别提出了“multi-priming”和“templateswitching”两种新机制。经研究发现,RNase H 引物 存在 2 个或更多 RNA 残基时,RNase H 会优先切割 RNA 残基 5' 端,并且是从引物上最后一个 RNA 残 基开始一个一个切割,即使只剩最后 1 个 RNA 残基, RNase H 也能有效切割残基的 5' 端。但是,“multipriming”和“template-switching”两种新机制都是基 于只切割引物上最后一个 RNA 残基 5' 端建立起来 的,因此,实际上,ICAN 的扩增机制可能会更加复杂。

与其它核酸扩增技术一样,ICAN 也可用于病原 菌检测。Isogai 等使用 ICAN 通过扩增 invA 基因 来检测死鸡、蛋黄和牛粪中的沙门氏菌,且在死鸡 冲洗液的检测中,ICAN 的检出率高于 PCR。Horii 等结合层析技术,应用 ICAN 成功快速检测出淋 球菌对氟喹诺酮类药物的抗药性。Urasaki 等在 ICAN 的基础上,引入环状探针,对 44 个样品中的 柑橘黄龙病菌进行检测,相比常规 PCR,ICAN 的检 测时间可以至少节约 2 h,同时灵敏度更高。

综上,ICAN 的主要优点在于扩增效率高、稳定 性好、扩增对象范围广,除了双链 DNA,还可作用 于 cDNA :RNA 杂合链。但是,由于 ICAN 使用的 引物是嵌合引物,由 RNA 和 DNA 构成,合成较复杂, 且扩增机制不明确,进而不利于该技术的发展。

2 依赖于切刻内切酶的等温扩增技术

解决不依赖高温使 DNA 模板变性进而引发扩 增反应,是实现真正等温扩增反应的瓶颈。虽然, DNA 解旋酶等被用来产生 DNA 单链,但是效果一般, 反应机制复杂。切刻内切酶的发现,使得等温产生 DNA 单链成为可能。切刻内切酶(Nicking Enzyme), 也称为切口酶,由美国 NEB 公司开发,其为一种限 制性内切酶,能够识别特异性的核苷酸序列,并且 在序列内部或首尾处发生单链切割 ;该过程对底物 DNA 没有要求,即不需要有任何化学修饰。因此, 依赖切刻内切酶作为反应第一步的等温扩增技术逐 渐被发展起来。

2.1 链置换扩增技术(Strand displacement amplification,SDA)

置换扩增技术是一种 DNA 体外等温扩技术,由 美国 Beetonniekinson 研究中心 Walke博士团队 于 1992 年首次报道,此方法的建立标志着一种新型 DNA 扩增技术的诞生。

SDA 反应全过程主要依赖于限制性内切酶对半 硫代磷酸化碱基对应互补链的切割作用,以及聚合 酶 exo-klenow 对切口的延伸作用和对下游 DNA 片段 的置换作用。SDA 由两条引物 P1 和 P2 进行扩增, 两条引物的 3' 端和 5' 端分别含有特异性结合序列和 Hinc II 识别序列,其具体的扩增方式是 :限制性内 切酶首先识别半硫代磷酸化碱基对应的互补链,然 后切割该位置并产生单链切口 ;被切割部分的 5' 上 游端能够作为一条引物,在具有链置换活性的 DNA 聚合酶的作用下从 5' 端向 3' 端延伸扩增,从而剥 离原本已经形成互补的 DNA 链 ;被取代下的单链 DNA 再与另一条引物结合,相同原理下延伸形成一 条新的双链 DNA。SDA 反应即是通过这种“切口 - 扩增 - 置换”循环往复的过程,达到靶序列高效扩 增的目的,其一般反应条件为 37-40℃,经过 2 h 循 环靶序列可得到 108 倍的扩增量。

 SDA 被发明后,在 20 余年的发展更新中,该 技术在细菌病毒检测、核酸定量、重金属检测及芯 片杂交等多个方面有相关报道,同时也衍生出了 一些新方法。Little 等 将 SDA 与荧光共振能量 转移技术结合,开发出新一代 DNA 探针系统—BD ProbeTecTM ET 系统,用于检测沙眼衣原体、淋病奈 瑟菌和人乳头状瘤病毒 ;Nuovo 等应用 RT-SDA 检测丙型肝炎病毒 ;Li 等研发出一种 SDA 结合 核酸酶高效检测二价铅离子的方法。

SDA 提供了一种可用于核酸诊断分析的扩增方 法,具有等温核酸扩增的通用优势 :无须热变性、 特异高效、操作简便,只需一个恒温器,大大简化 56 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2017,Vol.33,No.7 了对所需仪器的要求。但是 SDA 由于反应原理和 反应体系的复杂性,不可避免的带来了很多缺点 : 非标准核苷酸的使用,经硫基修饰的单核苷酸在价 格上比普通的单核苷酸高出很多倍,增加了反应成 本;经硫基修饰的单核苷酸不是 DNA 聚合酶的 天然底物,修饰的核苷酸与标准核苷酸存在竞争关 系,聚合酶容易从 DNA 模板上掉落,大大降低了扩 增效率降低了扩增效率,所以,SDA 不可能合成较 长的产物,一般不超过 200 bp;SDA 产物末 端带有限制性核酸内切酶的识别序列或其残端,使 其不适合直接用于克隆,因此,该技术在基因工程 方面不占优势;SDA 的等温过程是两步法,需要 首先有变温过程打开双链与引物退火,这就需要酶 体系在变温环节后添加,增加了外源污染的可能性。

2.2 指数扩增反应(Exponential amplification reaction,EXPAR)

指数扩增反应由 Van Ness 等于 2003 年开 发,该技术利用扩增模板合成寡核苷酸,长度为 8-16 mer,可用于位点多态性研究。反应试剂中 的 N.BstNBI 切口酶在反应中发挥着至关重要的作用, 因此,也可以把该技术称为切口酶扩增反应(Nicking enzyme amplification,NEAR)。

EXPAR 能否顺利开展,取决于触发反应。而触 发反应存在着不同的机制,其中最简单的一种机制 是依赖基因组 DNA 上存在着切口酶的识别序列。单 链基因组 DNA 与触发模板退火结合,双链识别序列 形成,激活切口酶切割单链基因组 DNA 识别序列, 缺口下游带有 3' 悬挂的 DNA 序列,其在 60℃下自 动解离,同时上游 DNA 序列以触发模板为模板,在 DNA 聚合酶的作用下开始延伸,合成平末端的 DNA 序列。与此同时,新形成的识别序列再次被切割, 缺口下游的 DNA 序列自动解离,成为触发子。上游 DNA 序列继续延伸,切口酶继续切割,从而线性生 成触发子,反应进入指数扩增阶段。形成的触发子 与扩增模板 3' 端序列结合,在 DNA 聚合酶的作用 下开始延伸,形成双链 DNA,切口酶切割识别序列, 形成缺口,缺口下游序列自动解离,解离的单链片 段随即与自由的扩增模板结合形成短暂双链结构, 在 DNA 聚合酶的作用下,解离的片段一旦开始延伸, 双链结构就会稳定下来,不会轻易解离,最终生成 新的双链 DNA。新生成的双链 DNA 重复之前的过程, 继续合成其它新的双链 DNA。在这个过程中,每个 双链 DNA 也会线性生成单链片段,从而达到指数扩 增的目的。

EXPAR发展至今,已被广泛应用于检测蛋白 质 和 DNA。Nie 等基 于 EXPAR, 开 发 出 GQEXPAR,这是一种依赖 G- 四链体的双重扩增技术, 可通过联合比色法检测 DNA。Ma 等创建了一种 用于检测转录因子的技术,该技术是在 GQ-EXPAR 的基础上,再加入 RNA 转录技术实现检测的目的。 Yu 等联合 EXPAR 和 HCR 开发出一种电化学传 感器,可对 H7N9 病毒实现超灵敏检测。EXPAR 的 主要优点在于:反应形式多,可满足不同的扩增需求; 反应稳定性好,速度快,灵敏度高。但由于反应机 制复杂,产物产量易受扩增模板限制,使得后期会 从指数扩增转变为线性扩增。

2.3 切刻内切酶介导等温核酸扩增技术(Nicking enzyme mediated amplification,NEMA)

切刻内切酶介导等温核酸扩增技术是 2006 年 研发的一种全新的核酸恒温扩增技术,该技术是在 SDA 的基础上发展而来的不依赖于特殊化学修饰的 等温方法。NEMA 反应体系中使用的切刻内切酶, 是一种能够识别特异性的位点并发生自然单链切割 产生缺口的酶,切刻内切酶的使用克服了传统 SDA 反应中需要添加化学修饰的非标准核苷酸的缺陷, 简化了反应体系,提高了反应效率,成本更低,并 且可合成长链 DNA。

NEMA 反 应 体 系 包 括 两 对 引 物( 剥 离 引 物 B1/B2,切割引物 S1/S2)、一种具有链置换活性的 DNA 聚合酶、一种能够识别特异性切割位点的切刻 内切酶、额外添加的镁离子以及适宜的缓冲溶液。 NEMA 技术是建立在 SDA 的原理技术上改进发明的, 因此二者基本扩增原理相似。NEMA 扩增分为“切 割单链形成切口”和“链置换剥离旧链”两个过程, 在待扩增的 DNA 双链模板上有一段切口酶特异识别 的序列,在切口酶的作用下只切割其中一条链,然 后 DNA 聚合酶以形成的切口为起点,以未被切断的 单链为引物延伸形成新链,置换旧链,产物作为新循环的模板不断参与新一轮的指数扩增。体系中还 存在另外一种模板,就是只上游或者下游一端引入 了切刻内切酶识别位点的序列,这种状态的靶序列 同样是以不断结合杂交互补的切割引物参与扩增, 然后发生单链切口切割,在 DNA 聚合酶作用下链置 换,如此的往复循环过程。

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相较于 SDA 和其他目前开发的等温核酸技术, NEMA 具有一些潜在的优势 :酶体系和原材料体系 的简单减少了抑制因子的干扰 ;扩增迅速,反应时 间短,在 1 h 之内就能达到电泳凝胶的观察要求 ; 低成本,操作简单,对操作仪器的要求不高,为核 酸扩增技术的推广创造了条件。但是 NEMA 目前还 处于探索阶段,多数应用在微生物质粒 DNA 的检测 方面。

3 结语

本文介绍了 10 余种等温扩增技术,其中每种技 术均有各自的优势,表 1 比较了上文提到的几种等 温核酸扩增方法的技术特点。尽管等温扩增技术有 着普通 PCR 扩增不可超越的优势,但是有些缺点也 是不容忽视的。不过,随着进一步研究,对生物过 程的了解越来越深入,相信未来将会有更多更完善 的新型等温扩增技术不断涌现。

等温扩增技术是在单一温度下对靶序列进行扩 增或信号放大,不依赖便携性差、价格昂贵的热循 环仪,进而在近 20 多年得到快速发展,尤其是在微 生物检测领域中。我国现行标准(GB/T,SN/T 等) 中有多项采用了等温检测的方法,包括金黄色葡萄 球菌、产气荚膜梭菌、创伤弧菌、阪崎肠杆菌、沙 门氏菌等致病菌 ;猪圆环病毒 2 型、家畜布鲁氏菌、 焦枯病菌、甘蔗病原菌和猪瘟病毒等。等温扩增技 术对仪器要求简单,仅以电池为电源的加热器即可, 未来可在边远地区和基层医疗单位等缺乏资金和先 进检测设备的地区大力推广,使其具备快速诊断病 原体的能力。检测时间短也是等温扩增技术的优势, 可在实时现场检测与监测领域推广,如在突发公共 卫生事件的现场诊断中,等温技术对传染性疾病的 早期发现和控制具有重要的意义。

历经了 20 余年的发展,在市场上仍然看不到任何已 经被广泛使用的相关设备。但是,导致这种现象的原因并非等温扩增技术不适用,而是因为这是一个 复杂的工程问题,是一个涉及多领域的难题。想 研发出以核酸为靶物质的便携快速即时检测设备, 我们需要对等温扩增技术进行更多的优化,比如扩 增速率,电力需求等等,同时需要解决将等温扩增 与上下游操作结合在一起的技术难关,如结合样品 核酸的提取纯化以及后期的扩增产物检测。随着 微型品制造技术与等温扩增技术的不断提升,相 信在不久的将来将会出现突破性的进展。

文献来源:DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0106

作者:王大洲, 郭天笑,郑实,商颖,许文涛

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