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从层析荧光到微流控生物芯片-现场快速检验(POCT)技术

现场快速检验(Point-of-Care Test, POCT),也称即时检验,国际上通称的POCT,是体外诊断行业增长最快的领域。被广泛使用的血糖仪即为最成功的POCT产品,占有整个POCT市场60%以上的份额。目前市场上最有代表性的两种便携式POCT技术是胶体金(或荧光)免疫层析技术和荧光免疫毛细技术。前一种以多家中国公司的产品为代表,后一种以美国Alere公司的Triage产品系列为代表。免疫层析技术起始于上世纪80年代初,而Triage产品的开发始于上世纪90年代,都已有了二三十年的历史。近两年来,中国、美国等世界上主要国家都在大力推行精准医疗、并已把精准医疗定位为长期战略发展方向。精准医疗首先需要精准诊断,这就对医疗检测仪器的性能提出了全新的要求。在此大背景下,两项关键技术在医疗检测行业迅速发展,一个是生物芯片技术,另一个是微流控技术。理邦m16磁敏免疫分析系统(生产单位:深圳市理邦精密仪器股份有限公司,简称理邦)是其中一个具有代表性的产品。它把微阵列生物芯片集成进了微流体器件里面。其生物芯片是一个多层纳米膜结构的微阵列、是通过大规模集成电路工艺制造的。相对于传统意义上以玻璃片为基底、以荧光材料为标记物的基因芯片,m16上的生物芯片是在单晶硅片上实现的、通过量子力学现象传感的技术。其微流控技术依赖于机械机构对被测样本和测试试剂实现精确控制。

1.免疫层析技术

技术原理

1所示的是胶体金免疫层析测试卡的结构,由样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫构成。其中,胶体金颗粒上修饰有检测抗体,硝酸纤维素膜上有检测线和控制线。检测时,被测样本在毛细作用下通过胶体金标记的抗体,形成抗原抗体胶体金复合物,复合物继续爬行,通过包被有捕捉抗体的检测线,形成双抗体夹心胶体金复合物,在检测线处呈现色带。过量的胶体金抗体流过检测线,在之后的控制线上形成胶体金免疫复合物,呈现色带。需要注意的是,控制线上色带的形成与被检测物质的存在与否无关,即使样本里没有被检测的物质,控制线也会显现。这种“捕捉抗体-抗原-检测抗体-胶体金纳米颗粒标记物”复合结构被称为双抗体夹心结构,胶体金为指示标记。最典型的产品是“早早孕”试纸条,采用双抗体夹心一步法技术,以胶体金为指示标记检测尿液中的人绒毛膜促性腺激素(Human Choionic Gonadotophin,HCG)浓度,以判断受检者是否受孕。

图1 免疫层析技术原理

1 免疫层析技术原理

质量控制

2所示是免疫层析产品的生产过程。首先在大张层析膜上喷画控制线和检测线,然后把此大张层析膜粘贴在支撑底衬上。这个过程必须要确保底衬和膜的接触紧密、均匀一直,否则将会导致不同测试条(卡)之间的液体流动速度和方式有很大的不同。下一步是粘贴胶体金垫、样品垫和吸水垫。吸水垫和胶体金垫各自和硝酸纤维膜有部分交叠,样品垫覆盖了胶体金垫的一部分。这里面最需要注意的是各层之间的交叠、接触需要密切、均匀,不能在任何膜层表面引入物理变形、污染物、或者化学杂质。很多和液体流动均匀性有关的问题都和以上这几个过程有关。最后一步是在温度和湿度都受控的房间里,把上面制作的大张材料切割成一条条的试纸条,组装入塑料壳。

图2 免疫层析产品的制造过程

2 免疫层析产品的制造过程

从上面的制造过程可以看出,同一大张材料上切割出来的测试卡的一致性会比较好,因为是在同一个时间、同一个环境条件、用同一片材料、同一次制作过程完成的。比较难以控制的是不同批次间的差别。所以质量控制也应该主要关注批间差。

建议质量控制流程如下:

保留最少18个质量有保证的测试卡。

准备最少两个浓度的样本,一个是在cut-off值附近,另一个是中值。

如果有检测全血、血清、血浆等不同样本的需求,则需要按照2来准备不同的样本。

每个浓度点测试3个卡,计算平均值。

如果平均值相差超过10%,则新批次测试卡不合格。

如果使用温度和室温(25℃)相差较大,则需要和室温结果比对。

以上第二项考虑的是,如果测试卡存在问题,那问题在cut-off值附近会被放大。第三项的考虑是不同的样本黏稠度不同,对胶体金垫上颗粒的稀释能力会不同,在硝酸纤维膜里的流动速度会有差别。而从前面的讨论我们知道,样本在膜中的流动速度是对测试结果影响最大的因素之一。第四点、第五点考虑的原因是,免疫检测不可能100%完全重复,需要平均并给与一定的误差量。

值得一提的是,胶体金免疫层析、荧光免疫层析、上转发光免疫层析这三种产品都是建立在“层析”这个技术平台上,所以以上的讨论对三种技术均适用。但是,荧光的使用使检测灵敏度得到了一定程度的提升。荧光免疫层析的一个很大的问题是散射的入射光对检测信号的干扰,而使用上转发光可以有效地消除这个问题。

2.微流体技术

从上面的讨论我们可以知道,层析检测技术是一项看起来很简单、但是实际上很复杂的技术。里面最少有4种薄膜、两种抗体、抗体修饰的胶体金颗粒、缓冲液、封闭液等。制造过程最难把控的因素来源于:①把各种生化试剂载入相应的材料中并进行干燥;②把各种材料完美、重复的组装在一起。任何存在于各层材料之间的界面缺陷和界面不重复性都会直接导致检测结果的重复性变差甚至失败。解决这些问题的一种办法就是摈弃层析这个平台。美国Alere公司旗下的Triage产品系列就是采取了这样一种方略。

图3 Biosite微流体测试卡结构

3 Biosite微流体测试卡结构

3所示是美国Alere公司旗下的Triage产品系列的测试卡结构,其中没有任何的薄膜材料。它有上下两层材料组成,两层材料之间的距离是可以产生毛细现象的距离。上层为高度透明材料,目的是可以使在两层材料之间产生的荧光信号不受干扰地传播到透明材料另一侧的荧光检测器件上。底层表面的地貌随需求变化而不同,而最突出的特征就是“搓衣板”地貌。这样一个“搓衣板”地貌可以有效的增加表面积、增加抗体固定量及固定强度。在测试区域的表面上修饰的主要是捕捉抗体和封闭试剂,在样本准备区域的不同部位上修饰有荧光标记物、检测抗体、缓冲试剂、封闭试剂等。样本进入测试卡以后,其中液体溶解各种生化试剂,毛细作用推动试剂向检测区流动。

毛细现象是一种自然界发生的被动现象,会随着环境条件及液体特性而发生变化。要想解决这个问题,就必须对微流体进行控制。理邦的m16磁敏免疫检测平台采用的就是这个理念。图3所示是理邦m16产品系列微流控测试卡流体线路图。在这里称之为微流“控”而非微流“体”是因为它对微流体的流动实现了控制的功能。在这个微流控结构里共有三个线性微流体,分别对三种试剂进行控制。根据理邦提供的数据,驱动装置是由步进电机构成,每1 mm的驱动距离可以分为25000步,也就是说,每一步的驱动位移是40 nm。微流体泵体的直径大约是3 mm。换算成体积,步进电机每走一步所移动的试剂体积是0.0028μL,实现了精确控制。因为是微流体泵控制的流动,也因此避免了因样本组分或黏稠度不同而导致流速不同、测试结果不同的问题。另外,因为速度是可以调节的,所以可以针对不同的检测项目(心肌标志物、炎症、传染病)进行优化,以达到最佳检测结果。

图3 理邦m16微流控测试卡结构

3 理邦m16微流控测试卡结构

在前面所描述的层析和毛细微流体平台中,样本中的液体作为溶剂把各种生化材料溶解在一起流到反应区域。在检测区和背景区域结合上的非特异信号物是靠最后残留的多余样本进行清洗,没有专用清洗液体。在这两个方面,m16平台采取了完全不同的方案。为了避免各种试剂之间的相互干扰或交叉反应,m16微流控测试卡采用了3个微流体泵,对不同的试剂依次分别注入反应。在注入不同的试剂之前,微流体泵驱动的清洗液对反应空间进行彻底清洗,有效的消除非特异吸附。m16的另一个独特之处是微流体泵不仅可以控制试剂和样本的流动速度,而且可以控制其流动方向。反应试剂可以前后来回震荡,增加反应结合律也即检测灵敏度,清洗试剂可以通过来回震荡来达到彻底清洗的目的。

3.生物芯片

生物芯片这个用语最早出现在基因检测领域,由美国Affymetrix公司首先使用。图4是该公司在2003年为罗氏生产的检测CYP450基因的生物芯片,用于个性化用药。它是以单晶硅为衬底,通过多层掩膜版的制造过程,在几十万个20 µm2的检测区上合成出不同的基因片段。因为使用了单晶硅硅片,采用了半导体行业常用的掩膜版光刻技术,最后产品外观和半导体芯片非常类似,故被称为生物“芯片”。类似技术已经在基因检测领域大规模使用,但是在免疫检测领域还没有产品出现。

图4 美国Affymetrix公司的CYP450基因生物芯片

4 美国Affymetrix公司的CYP450基因生物芯片

理邦的m16磁敏免疫分析仪采用了通过多层纳米膜淀积、多层掩膜板光刻等大规模集成电路工艺制造的生物芯片技术。图5是其示意图,其中每一个彩色正方形下面是一个由多条亚微米宽的巨磁阻器件构成的检测区,每个检测区上修饰有不同的捕捉分子,用来检测不同的标志物。此示意图中共有12个检测区,可以检测12种不同的生物分子。和Affymetrix芯片最大的不同是,m16生物芯片不仅仅是捕获被测物质的载体,它还探测被测物质生成的信号。信号通过导线传输到仪器上,然后转换成用户可以使用的信息。Affymetrix的芯片只是捕获被测基因的载体,其上产生的荧光信号要通过一个荧光扫描设备来读取。

图5 理邦的m16磁敏生物生物芯片示意图

5 理邦的m16磁敏生物生物芯片示意图

m16生物芯片的工作原理如图6所示。首先通过大规模集成电路工艺在硅片上生产巨磁阻(GMR) 微阵列芯片。GMR芯片有极高的灵敏度、可以检测到单个纳米磁颗粒[6]。硅片切割成单个芯片以后,首先在上面修饰上捕捉抗体。当样本被加到芯片上以后,其中的被测分子和捕捉分子发生反应、结合。然后加入修饰有检测抗体的纳米磁颗粒,检测抗体和被测分子结合,形成图6所示的复合结构。纳米磁颗粒作为标记物被GMR器件检测。在样本中被测分子含量很低、也即需要高灵敏度的情况下,一个磁颗粒下面只会有一个被测分子。因为GMR器件可以检测到单个纳米磁颗粒,所以这样一个结构就具有了检测单个生物分子的超高灵敏度。

图6 理邦m16磁敏生物芯片检测原理

6 理邦m16磁敏生物芯片检测原理

m16磁敏生物芯片是微阵列芯片,其上有多个检测区域,可以同时检测多种物质。比如,肝功4项、心肌标志物五项、呼吸道感染9项、肿瘤12项等,可以用单个微量样本在同一个微流体测试卡上得到结果。更重要的是,部分检测区可以被用来进行实时监测、校准,提高检测结果的可靠性和一致性。在公式2的讨论中我们提到,抗体抗原的最佳反应温度是37℃,偏离此温度会使反应速度降低、检测结果变弱。在理邦m36的芯片上,有两个温度偏差校准区和一个反应过程校准区,可以实时校准此项因素。这项技术的另一个直接结果是,测试卡从低温储藏室取出后可以马上进行测试、不需要恢复到室温,这对急性心梗等需要快速结果的应用非常有利。试剂批次校准区可以校准运输、储存、试剂批间差等因素。另外根据需要,还可以在芯片上设计假阳性、假阴性校准,使检测结果的准确性和可靠性有巨大改进。

图7 理邦m36磁敏生物芯片应用方案一例

7 理邦m36磁敏生物芯片应用方案一例

4.免疫层析技术面临问题及解决方向

随着医疗领域各项技术的发展,尤其是随着精准医疗、个性化医疗的迅速发展,检测技术也在两个方面面临着挑战:第一是重复性,第二是灵敏度。对免疫层析技术来讲,测试条之间的重复性问题是最大的挑战,而重复性差的原因很大一部分是因为需要把多种纤薄、脆弱的材料粘贴在一起、同时保证其中液体流动的一致性。为解决这个问题,一些公司在开发新的材料和结构。Whatman公司的Fusion 5 单一薄膜代替了样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫[7]。Fusion 5 是一种大孔隙材料,液体在其中的流动速度很快,但是和蛋白质没有亲和性。同时,常规层析免疫产品使用的多次浸润、干燥过程也不再适用,所以,需要一个完全不同的制造过程。目前市场上使用Fusion 5的产品并不多见。

解决以上所述重复性差的另一个思路是彻底摈弃层析膜以及其他薄膜,采用微流体结构。但是,微流体器件的研发需要机械、流体力学、化学、生物、精加工等尖端技术领域的密切合作,研发时间长,投入大。所以,除了美国Alere 公司的Biosite 产品系列,还没有其他有影响力的产品出现在市场上。另外,从化学反应的角度出发,化学反应的结果受反应试剂量、反应温度、反应时间等因素影响,免疫反应也不例外。所以,对微流体的精确控制是进一步改进重复性的关键。理邦m16产品实现了对流体的控制。“微”流体的“微”字意味着产品的原材料以及生产过程需要严密控制。理邦通过精密注塑来生产合乎要求的零部件。组装线采用自动化机械手进行组装,可以实现不大于几十微米的组装公差。

美国海军实验室Baselt博士于1997年提出利用磁阻 (magnetoresistance, MR) 器件和磁标记物进行生物分子检测的概念[8]。因为发现了更加灵敏的巨磁阻(giant magnetoresistance,GMR) 现象, 法国科学家Albert Fert和德国科学家Peter Grünberg获得了2007年的诺贝尔物理学奖。目前用于磁敏生物传感器的主要为GMR器件。认识到GMR微阵列芯片在灵敏度上的巨大潜力,除了美国海军实验室外,美国NVE公司,美国斯坦福大学、德国比勒非尔德大学、葡萄牙里斯本大学等29个公司、大学、研究院都在进行磁敏免疫检测技术和产品的研究[9-12]。在国内,进行此研究的有中国科学院电工研究所、清华大学、上海交大、电子科技大学等,但是这些单位到目前为止还没有能够使GMR技术产品化,这里面最主要的挑战是GMR器件和微流体器件的集成[13]。理邦m16磁敏免疫分析仪是近20年来首个出现在体外诊断领域的全新技术平台,在灵敏度、重复性、多项目检测能力等方面有明显的技术优势。

在将来的POCT市场上,免疫层析技术仍将会发挥很大的作用,然而不论是从基本的原理上亦或是从制造过程来看,免疫层析技术的内在缺陷也不可忽视,难以满足精准医疗对检测精度的需求。为了应对这些挑战,一个研发方向是把几种薄膜材料进行无缝集成、免去多个不同而且难以控制的组装过程;另一个方向是对制造过程更精密的控制,把批次生产模式改成高度自动的流水线型生产模式。微流控技术可以精确控制生化反应过程(包括温度、时间、速度、剂量),以达到精准检测的目的。微阵列生物芯片技术可以使多项目联检成本显著降低,同时阵列内的各种实时校准单元可以使测试准确性和重复性大大提高。 

参考文献

[1] Kalorama Information, The WorldWide Market for IVD Tests, 9th Edition, 2014.

[2] C. M. Plotz, J. M. SINGER, The latex fixation test. I. Application to the serologic diagnosis of rheumatoid arthritis, The American Journal of Medicine, vol. 21, pp.888-892 (1956).

[3] Millipore C. Rapid Lateral Flow Test Strips-Considerations for Product Development. Millipore Technical Publications, 2008.

[4] C. L. A. Berli and P. A. Kler, A Quantitative Model for Lateral Flow Assays. Microfluidics and Nanofluidics, vol. 20, pp.1-9 (2016).

[5] G.K. Batchelor, 'An Introduction To Fluid Dynamics', Cambridge University Press (1967) ISBN 0-521-66396-2.

[6] G. Li, V. Joshi, R. L. White, and S. X. Wang, Detection of single micron-sized magnetic bead and magnetic nanoparticles using spin valve sensors for biological applications, Journal of Applied Physics, vol. 93, No. 10, pp.7557-7559 (2003).

[7] www.whatman.com(Fusion 5).

[8] 美国专利US 5981297.

[9] www.nve.com.

[10] www.magarray.com.

[11] S. J. Osterfeld et al, Multiplex protein assays based on real-time magnetic nanotag sensing, PNAS, vol. 105, pp 20637-20640 (2008).

[12] F. A. Cardoso et al, Detection of 130 nm magnetic particles by a portable electronic platform using spin valve and magnetic tunnel junction sensors, Journal of Applied Physics, vol. 103, pp.07A310-1-07A310-3 (2008).

[13] L. Chen et al, A prototype of giant magnetoimpedance-based biosensing system for targeted detection of gastric cancer cells, Biosensor and Bioelectronics, vol. 26, pp.3246-3253 (2011).

(文章来源: (有改动)《中国医疗器械信息》 单万水  科学网科学网转载仅供参考学习及传递有用信息,版权归原作者所有,如侵犯权益,请联系删除)



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