微流控芯片技术在细胞裂解、计数、凋亡检测、迁移、单细胞捕获、细胞间作用的研究与应用

20世纪90年代以来,微流控芯片技术得到了快速发展。由于具有小型化、集成化、高通量、低消耗、分析快速等特点,微流控芯片作为一种新型的生物学研究平台,能够提供传统方法不具备的精细和可控制的细胞研究条件,在细胞生物学研究领域中得到了广泛关注。本文介绍其在细胞裂解、计数、凋亡检测、迁移、单细胞捕获、细胞间作用等方面的研究进展。

1.细胞裂解

细胞裂解是对细胞内物质(核酸、蛋白质、信号小分子等)进行分析的关键步骤。根据细胞破裂的原理可将细胞裂解方式分为以下几种:物理裂解、化学裂解、电裂解。物理方法主要指采用冷冻、渗透压、剪切力和超声波等破碎细胞。化学方法则指用酶或表面活性剂处理细胞膜,从而使细胞裂解。电裂解法是使用电脉冲或连续的直流电,将细胞破碎。

化学裂解中常用的使细胞膜变性的试剂有TritonX-100、盐酸胍、蛋白酶和十二烷基磺酸钠(SDS)。图3A为采用化学试剂进行细胞裂解的芯片,在a-c口分别加入磷酸盐缓冲液(PBS)和裂解液SDS、TritonX-100,在d口加入胎牛血清,继而引入要裂解的细胞,细胞在图中通道交叉处裂解,细胞裂解物在下游被检测。但化学裂解法会将细胞器膜一起破坏,不适用于亚细胞结构分析,除此之外还需要对细胞裂解物进行分离纯化,操作相对麻烦,裂解试剂的使用还可能干扰下游对目标物质的检测。

细胞膜的双层结构是绝缘的,但暴露在电场中的细胞会产生一个跨膜电势,当跨膜电势超过大约1V时细胞便会发生裂解。Lu等在芯片上设计了锯齿状电极,并使用交流电对细胞进行裂解,通过控制电压大小及频率,使细胞膜破裂而细胞器膜保持完整,为在亚细胞水平进行分析提供了可能。细胞膜一般需要在较高外加电场强度下(约1000V/cm左右),才能获得大约1V的跨膜电势而发生裂解。由于细胞进样需要在较低电场强度条件下,Lee等通过改变微流控芯片通道的宽度解决了这一问题,如图3B所示,他们将细胞裂解区通道宽度较其它区域缩小20倍,则该区域的电场强度则达到其它区域的20倍,从而实现了细胞的低场强进样,高场强裂解。一般的细胞电裂解使用的都是二维电极,对细胞膜产生不均一的力作用,有人采用了高50μm、直径50μm的三维柱形电极对白细胞进行裂解,可以极大地提高裂解效率。细胞电裂解可在短时间达到裂解效果,最快可达33ms,比SDS裂解的速度快8倍。

图3细胞裂解装置示意图

A:微流控芯片裂解和孵育HL-60细胞示意图,裂解液和作用物从a-c口注入,细胞从d口注入,荧光探测器和显微镜位于下游交叉处;B:采用低直流电压连续裂解细胞装置,微通道宽度为200μm,裂解处孔的宽度为10μm;C:无线感应生热裂解细胞芯片示意图,将边长6mm的六边形金属片整合到两层PDMS中间,整个装置包括一个入口(1),三个小室(2-4),一个出口(5),加热元件(6)和感应线圈(7)。

电裂解在高效快速的同时也存在一些弊端,如电极寿命短、操作过程复杂、需要外加电源。为克服这些缺点,Baek等设计了一种无线感应生热裂解细胞的装置,如图3C所示,芯片底部放置一个直径6mm粗的感应线圈,两层PDMS中间有厚度为100μm的六边形金属薄片,感应线圈通电后,通过电磁感应现象,金属薄片发热,进而将上层芯片小室中的细胞裂解。

2.细胞计数

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好,因此要进行细胞计数。细胞计数通常与细胞分选、裂解等功能一起整合到微流控芯片上。对细胞计数,常使用的方法有荧光检测、数字图像处理技术(CCD图像传感器)和阻抗测量。前两种方法主要是将流式细胞仪与微流控芯片结合起来,细胞用特殊荧光素标记,受激发后产生荧光,经光电转换器转换成电信号计数细胞。利用阻抗测量的方法也可以在芯片上实现对血细胞的计数,当细胞流经检测区域时,溶液电导率、电容、电阻发生变化,产生脉冲信号,脉冲信号的多少即反应了细胞数量的多少。除此之外,还可在芯片上嵌入一对光纤维,当细胞流经两纤维之间时,光被挡住,这一信号被捕捉并转化成电信号,对流过的细胞进行计数。CD4+T淋巴细胞的计数在HIV阳性患者的检测中起着重要的作用,目前,利用上述方法已经成功实现了在微流控芯片上对CD4+T淋巴细胞的计数,但检测前需在通道中注入单克隆抗体以捕捉T细胞。Imaad等[58]还设计了一种新颖的装置来实现细胞的计数,如图4所示,他们将PDMS与光碟(compactdisc,CD)整合在一起,将二进制数据写到光盘上,用相应的输出数据组成音频文件,将音频文件刻录到可录光碟中,当有细胞出现时便会采集到错误数据,以此来实现细胞计数。

图4微流控芯片细胞计数研究

装置包括5层:PDMS层、聚碳酸酯薄层、光敏染料层、金属反射层和塑料保护层。

3.细胞凋亡

细胞凋亡是一种特殊的细胞程序性或自杀性死亡,通过消除体内不需要的细胞来维持组织稳态和调节免疫应答。增强或抑制细胞凋亡可导致发育缺陷、自身免疫缺陷病和神经退行性病变。细胞凋亡除了在胚胎和大脑发育过程起调节作用外,还与很多疾病有关,包括心脏病和癌症。伴随着细胞凋亡过程,细胞形态和功能会发生变化,如细胞皱缩、核质浓缩、线粒体外膜跨膜电势消失、通透性改变、释放细胞色素C到胞浆、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)激活、细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻,最终形成凋亡小体。

细胞凋亡过程中DNA会形成长度为50~300Kb的片段[65],依据这一特征Klepárník等设计了一款芯片用于检测多柔比星(doxorubicin)诱导的心肌细胞的凋亡,细胞在碱性环境下裂解,用溴化乙锭标记DNA,电泳分离后在共聚焦显微镜下观察DNA片段长度,以此来判断细胞凋亡的程度。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)是一类在天冬氨酸残基处裂解蛋白质的蛋白酶家族,在细胞凋亡过程中起调节作用。Randall等在微流控芯片上实现了同时捕获并诱导淋巴细胞凋亡,他们将抗CD-95的抗体粘附在玻璃基底上,连有脂肪酸合成酶(Fas)受体的细胞流经微流控芯片通道时被捕获,与此同时经由caspases-8途径诱导淋巴细胞凋亡,被固定在通道表面的细胞被认为经历细胞凋亡过程。Dai等设计了浓度梯度的芯片检测细胞凋亡程度,将青色和黄色荧光蛋白用含有caspase-3裂解位点的短肽连接,通过质粒转染HeLa-C3细胞,然后用不同浓度的依托泊苷(一种治疗肿瘤的药物)处理细胞,凋亡的细胞激活caspase-3,在荧光显微镜下观察到绿色荧光,而未凋亡细胞可观察到蓝色荧光。除此之外,细胞凋亡时细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻,钙磷脂结合蛋白V(AnnexinV)与磷脂酰丝氨酸有高度的亲和力,利用这一特性,Zhao等以AnnexinV功能化的量子点为探针,在微流控芯片上检测经抗癌药物作用后白血病HL-60细胞的凋亡程度,荧光强度反映了细胞凋亡的程度,在单细胞水平上成功区分了凋亡和非凋亡细胞。

图5微流控芯片细胞迁移研究

A:左图为单个HeLa细胞通过微缺口的迁移研究,这个装置包括3个平行的通道和两排宽度为3μm和10μm的微缺口,右图箭头指示细胞核的位置,HeLa细胞从底部通道向中间通道迁移;B:汇合细胞创造边缘伤口过程,首先从三个入口灌入细胞,两天后当细胞汇合到一起时,分别灌注30mLPBS、胰蛋白酶和EDTA混合液,然后再加入表皮生长因子、细胞松弛素D和鬼比环肽;C:用于研究细胞迁移的开放性微流控装置。1:从底部观察到的芯片示意图。PDMS层包括细胞存储池和微通道,含有cAMP和叶酸混合液的微滴管放在微通道的前方;2:装置侧面观,细胞从储液池灌入,在玻璃层表面向微滴管方向移动;3:窄通道区域内细胞迁移示意图。区域内总共有16个通道,宽度分别为6,8,10,12μm,每隔宽度重复4次;4:两个宽通道区域内细胞迁移示意图,每个通道宽度为100μm

4.细胞迁移

细胞迁移也称细胞运动,指的是细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后产生的移动。细胞觅食、损伤的痊愈、胚胎发生、免疫、感染和癌症转移等生理现象都涉及到细胞的迁移,因此细胞迁移是目前细胞生物学研究的一个重要内容。目前,最常用的研究细胞迁移的方法之一是划痕法,Liang等设计了一种填充芯片来研究细胞的迁移,芯片由两层管道组成,下层用来培养细胞,上层管道用来控制液体流动及产生伤痕区域,每隔一段时间拍摄图像并计算出没有被细胞填充的区域,借此衡量细胞的迁移速度。Chaw等设计了如图4A所示的芯片来研究细胞的迁移,芯片共有三个平行的通道,中间通道与另两个通道间分别有多个宽3μm和10μm的缺口,其中上下两个通道灌入细胞和基本培养基,而中间通道灌入基本培养基和10%的胎牛血清,在趋化因子的作用下,上下两层通道中的细胞会按箭头指示方向运动。Nie等用胰蛋白酶消化产生划痕,观察细胞在表皮生长因子等作用下的迁移情况,实验过程如图4B所示,首先在三个并行的宽300μm通道灌注胚胎纤维细胞(NIH3T3),待细胞贴壁生长后用胰蛋白酶和EDTA混合液(TE)消化,然后加入基本培养基(DMEM)、表皮生长因子(EGF)、细胞松弛素D(CD)、鬼比环肽(phalloidin),观察细胞迁移运动。Jowhar等还设计了不同宽度的通道来观察盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)的迁移活动,通常情况下盘基网柄菌以单细胞形式存在,当食物匮乏时分泌环腺苷酸(cAMP)并在cAMP作用下聚集成多细胞,如图所示,将饥饿处理的极性细胞和未处理的非极性细胞分别用荧光标记,混合后引入到细胞储液池,在通道另一侧用微滴灌注入cAMP和叶酸混合液,观察两种细胞的迁移速率和迁移路径。

图6单细胞捕获示意图

A:左图为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽介导的细胞硫醇化过程。两端均含有巯基的九肽与CHO细胞表面结合,然后巯基官能团与金电极表面结合,捕获细胞。右图为整体单细胞捕获芯片示意图,当电场强度为50V/cm时,细胞被捕获在相应的交错电极;B:用于细胞捕获的蛇形通道结构示意图。细胞悬液从进口注入,单个细胞相继被捕获在捕获口袋,主通道宽50μm,捕获口袋直径20μm。

5.单细胞捕获

在传统的对细胞增殖、分化及细胞对外界刺激反应的研究中,通常把细胞样品看成是均一稳定的,而事实上细胞通常是异质性的,所以单细胞分析在理解细胞个体间的差异显得尤为重要。在单细胞水平进行研究相对于传统的细胞生物技术及分析方法更具优势,因为其能更精确、直接地观察到细胞、亚细胞水平的动态和不连续过程,使蛋白质定位及动力学的研究成为可能,同时可以检测单个细胞对相同的信号分子的不同反应。单细胞水平研究的前提是实现单细胞捕获,进而才能对其内含物进行分析或实现单细胞操控。目前,已经有很多成功应用的实例,比如Nicholas等设计了电场驱动单细胞捕获的装置,如图5A所示,中国仓鼠卵巢细胞(CHOcells)用合成的含有巯基的九肽(CCRRGDWLC)进行标记,然后将细胞悬浮液引入到微通道中,被标记的细胞与金电极表面结合形成金硫键,从而达到细胞捕获的效果。Takahiro等设计了捕获口袋来实现单细胞捕获,如图5B所示,蛇形通道两侧有直径20μm的捕获口袋,当细胞悬浮液流经通道主通道时,会有部分细胞被捕获,进而进行荧光标记、细胞裂解及内含物的检测。就目前看来,微流控芯片上进行单细胞操作有着非常好的应用前景,比如对神经细胞之间递质的传递,体外受精以及细胞之间相互作用的研究等。

图7细胞间相互作用研究示意图

A:NIH3T3与HepG2共培养示意图,上下两个通道用于灌注细胞,左边通道用于培养基的注入,右侧通道用于代谢废物的流出;B:巨噬细胞和成骨细胞共培养示意图,巨噬细胞位于上游培养区,成骨细胞位于下游培养区;C:T细胞与内皮细胞相互作用研究示意图,首先将HUVECs灌注到芯片上,并用肿瘤坏死因子(TNF-α)刺激诱导表面分子表达,T细胞用异硫氰酸荧光素(FITC)连接的CD3抗体标记,在荧光显微镜下观察T细胞,SLE:系统性红斑狼疮。

6.细胞间相互作用

细胞间相互作用是指细胞间的直接作用,在多细胞生物的发育及功能发挥中起着重要作用,并且在衰老及病理条件下可以维持体内的稳态。细胞间相互作用参与许多生理及病理过程,例如胚胎发育、伤口愈合、肿瘤侵袭和转移等。微流控芯片具有设计灵活的特点,在大量的微通道中可同时培养多种细胞,通过对3D胞外基质的引入可实时监测和控制生化因子和信号分子的产生及其浓度,更适合细胞间相互作用的研究。目前微流控芯片研究细胞间相互作用最常用的方法是细胞共培养。Liu等用芯片实现胚胎成纤维细胞(NIH3T3)和肝癌细胞(HepG2)的共培养,如图7A所示,两种细胞分别用不同的荧光分子标记,打开通道阀门,给予充足的营养,在荧光显微镜下可观察到NIH3T3向HepG2方向移动。Wei等设计了一种能更精确反映细胞间相互作用的微流控细胞共培养体系,如图7B所示,体系包括上游和下游细胞培养区,上游细胞培养区用来培养巨噬细胞,当用脂多糖(LPS)或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)给予刺激时,巨噬细胞分泌白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α,这两种代谢产物通过微通道网络结构形成浓度梯度,作用于下游的成骨细胞,促进成骨细胞分泌前列腺素E2。白细胞与内皮细胞的相互作用对白细胞在免疫系统中的迁移及功能发挥起着重要作用,而这两种细胞的相互作用需要细胞粘附分子(CAM)的参与,为了研究这两种细胞间的作用,Park等设计如图7C所示芯片,通过CAM的表达量来研究T淋巴细胞(白细胞的一种)与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)之间的相互作用。

微流控芯片技术自20世纪90年代出现以后,随着生物、材料、化学、物理工程和电子工程等学科的介入,目前已取得了巨大的发展,其最终目的是建立多功能芯片实验室。微流控芯片技术正以其独特的优势越来越多地应用到细胞生物学研究中,其不仅可以为细胞提供可控制的生存微环境,与其他分析方法结合检测细胞内生化过程,而且在细胞个体、细胞群体和多细胞生命体三个层次对细胞的生命活动进行深入研究。另一方面,微流控芯片仍处于发展初期,许多方面的技术还不成熟,如不能进行长期细胞培养;细胞三维培养中一些水凝胶和粘连蛋白的引入可能阻塞通道和妨碍物质传输;电裂解细胞时产生的焦耳热和气泡会影响细胞生长和代谢等。目前微流控芯片大多处于实验室概念化论证阶段,尚未达到理想的商业化和通用化程度;对微流控芯片技术了解不多的生物研究人员,应用起来还有一定的困难。但是,基于微流控芯片的突出优点和人们对新技术的需求,我们相信微流控芯片细胞实验室将成为细胞生物学研究的重要平台。

（文章节选自：微流控芯片技术在细胞生物学研究中的应用进展作者：姚琳　白亮　吴亮其　丁永胜*科学网科学网转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除）