用于丝状真菌抗真菌分析的液滴微流控平台（下）

通过基于液滴的分析评估的抗真菌功效结果的验证

通过比较基于液滴的分析以及WA和96孔板测定评估的kunshi抗真菌潜力的结果，验证了平台抗真菌评估的效率。使用WA测定法的抑制百分比最低。在所有测试浓度下，孵育 4 小时后，通过 96 孔板和液滴测定评估的抑制百分比彼此更接近于 WA（表 2）评估的百分比。在4小时和24小时的时间点，使用液滴测定法计算的抑制百分比介于WA和96孔板测定获得的值之间，所有药物浓度≤0.5μgμL-1，而在浓度≥2μgμL-1时，液滴测定中记录了最高的抑制。在不使用抗真菌剂的情况下，在所有三种测定（水琼脂，96孔板和液滴测定）中真菌孢子的活力为100%。

在本研究中，我们成功开发了一种基于液滴的微流控平台，用于对植物病原真菌链格孢的单个包封孢子进行抗真菌分析。这项工作依赖于植物病理学和杀菌剂分析方法领域的一系列关键新进展，例如：（1）开发了一种用于单孢子封装的片上方法，（2）演示了一种基于生物相容性液滴的测定，使用互花米孢作为丝状真菌的模型系统，在液滴中存活长达24小时， （3）使用基于微流体液滴的系统进行抗真菌分析的能力。基于微流控的杀菌剂分析平台可进行可重复的抗真菌分析。以前，已经专门进行了研究以执行基于液滴的操作，例如细胞封装，液滴混合，片上孵育，液滴合并和液滴分选。然而，这些液滴操作中的每一个都被证明是单独的模块，尚未组装到集成的抗真菌分析测定中。在这里，通过结合片上孢子活力和液滴中的抗真菌分析测定，我们能够开发一个基于液滴的平台，用于对植物病原丝状真菌 A. alternata 进行杀菌剂分析。

为了验证抗真菌分析平台，使用 WA 和 96 孔板测定进行了类似的实验。对于所有3种测定，在两个时间点测量互花米草孢子萌发的抑制百分比，即孵育4小时和24小时后，以检查昆氏抗真菌功效的持久性。在所有测试浓度下，通过液滴测定评估的抑制百分比更接近 96 孔板和 WA 测定（表 2）。Pearson相关性分析进一步证实了这些结果（表3）。皮尔逊相关系数衡量两个连续变量之间的统计关系或关联。它被称为测量感兴趣变量之间关联的最佳方法，因为它基于协方差方法。分析表明，在孵育4小时时，96孔板测定和液滴测定之间存在高度相关性（表3）。微量滴定和微滴测定之间的这种高度相关性可以解释为PDB饱和的环境，类似于水和营养物质的可用性，与传统的96孔板高度相似。相关性分析表明，在平台上获得的结果与在WA和96孔板24 h获得的结果没有显著差异（P < 0.05）。因此，该平台可用作进行抗真菌分析的工具，其结果将与传统的 96 孔板和 WA 检测获得的结果相当。在孵育4小时时发现的液滴测定与WA之间的相关性较低，这可以通过以下事实来解释：WA技术依赖于测试化合物扩散到培养基中，因此与稀释方法相比，培养基中的浓度不均匀。液滴测定和 96 孔板和 WA 测定之间抑制百分比的总体差异是由于 WA 和 96 孔板方法对孢子的批量分析，这是基于液滴的平台通过直接可视化微流控芯片中封装的孢子来解决的问题。此外，微流控芯片具有存储位置，可以不受分析时间的影响来观察相同的孢子，与96孔板和WA检测相比具有优势。该资产是基于 droplet 的平台的主要功能之一。最后，在3种不同的孢子萌发试验中，计算了半最大有效浓度（EC50）的孢子抑制作用。通过液滴和 96 孔板测定评估的范围为 0.125 至 0.25 μg μL−1，而通过 WA 测定评估的 EC50 范围为 0.25 至 0.5 μg μL−1，表明这些化合物表现出剂量依赖性抗真菌活性。

已经有相对较少的已发表报告比较了确定对植物病原体的抗真菌功效的方法。据我们所知，杀菌剂评估测定方法尚未取得重大进展。在对涉及孢子萌发的技术的观察中，Gottlieb45发现接种的有毒物质琼脂法和试管稀释法同样敏感。这些结果与目前的结果一致，其中所有三种测定法测量的抑制百分比彼此接近，并且彼此密切相关，表明基于液滴的分析可以产生同样灵敏的结果。在另一项研究中，通过两种方法测试了月桂油、肉桂叶油、丁香油、柠檬草油、芥末油、橙油、鼠尾草油、百里香油和两种迷迭香油：（1） 补充有 100 和 250 μL L-1 精油的黑麦面包和 （2） 暴露于空气中 136 和 272 μL L-1 挥发油的真黑麦面包。结果表明，精油的抗真菌效果取决于施用方法。使用不同方法的研究进行比较是困难的，并且强调了在测试活动时需要统一和可靠的程序。

基于液滴的新型分析平台的结合有助于定制和优化现有体外模型中目前缺少的抗真菌评估技术，为研究真菌孢子的生物学和生理学提供了一个平台。液滴（直径100μm）以每小时5.4×103个液滴的通量生产，油压= 210 mb，孢子悬浮压力= 200，杀菌剂压力= 200。通过增加并行通道、多个微流控芯片和增加整体压力，可以提高平台的总吞吐量。HT分析可以通过将平台与芯片和陷阱的自动图像分析相结合来实现（例如使用自动显微镜和图像分析或高内涵筛选显微镜方法）。开发的平台可以通过优化条件，根据所使用的丝状真菌，在液滴大小、孵育条件（温度、光周期、培养基等）方面扩展到其他丝状真菌。基于液滴的抗真菌分析可以使用标准化方法，因为（a）它主要使用已经达到工业质量水平和生产标准的市售仪器，即光学显微镜，流量控制仪器，热塑性芯片，（b）一些关键步骤可以半自动或完全自动化和精细控制，例如流速或体积控制。微流控控制器带来的自动化有助于确保每个液滴的高重现性（相当于板孔），并减少人为错误的影响，（c）它依赖于单个孢子分析而不是批量分析。微流控芯片中单个封装孢子的直接可视化确保了结果的可靠性和可重复性，从而最大限度地减少了偏倚的结论。这也为验证对给定杀菌剂的反应的潜在异质性提供了可能性。微流控芯片中的特定存储位置使得观察相同的孢子与分析时间无关，与96孔板和WA测定相比具有优势，（d）结果重复了使用两种常规方法进行的观察结果，从而验证了本系统，并与此类传统方法相比具有互补优势， （e） 它包括明场显微镜分析，这是所有光学显微镜照明技术中最简单的。平台的简单性及其与基本设备（光学复合显微镜）的集成有助于将该平台作为标准分析工具，因此很容易被许多研究人员复制，（f）该系统包括一个市售的微流控芯片，该芯片已经满足大规模标准，可以用作现成的消耗品。与使用自制芯片（例如PDMS芯片、微铣削等）的其他微流控方法相反，这些方法在制造过程中可能会产生一些变化，而使用通常通过模具注射制造的众所周知的热塑性塑料（例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等）的大规模芯片生产通常具有显着较小的单元和批次之间的差异性， （g） 系统能够在较低的基础设施下进行抗真菌分析， 人工和消耗品。单个孢子的封闭允许在液滴内快速跟踪和观察，从而减少总体评估时间。该技术可以快速分析抗真菌活性，并可集成到工业杀菌剂筛选过程中，以加快发现新的抗真菌剂。这一优势将增加采用该技术及其向标准化模型发展的兴趣。该技术可用于封装具有不同孢子大小的不同类型的真菌，甚至是真核或原核细胞，例如细菌或哺乳动物细胞。精确的孢子封装、HT 液滴的产生和操作以及组合筛选的可能性表明，液滴技术可以用作一系列筛选方法的理想平台。我们开发了一种液滴技术，该技术不仅可用于任何大规模的抗真菌分析研究，而且还非常适合分析抗真菌剂的作用方式和真菌的耐药性发展。虽然我们只提供了获得的链格孢菌萌发抑制数据，但该平台可以进一步扩展，用于分析在细胞机制中起关键作用的抗真菌剂的分子机制。更深入地了解抗真菌剂的作用方式将有助于优化其应用，从而有助于它们在食品和饲料生产中的成功使用。通过在液滴产生后立即向芯片填充油，可以最大限度地减少液滴的蒸发和泄漏。使用了表面活性剂（1%），该表面活性剂在限制泄漏方面非常有效，并且可以有效地将亲水性和疏水性分子包含在液滴中。t = 0 h （100 μm），t = 4 h （99.97 μm） 和 t = 24 h （99.47 μm） 处的液滴大小。在不同时间点（t = 0，t = 4 h和t = 24 h）计算的液滴大小差异可以忽略不计，这进一步证实了液滴中抗真菌剂的泄漏是微不足道的。然而，根据所使用的生物活性分子（疏水性/亲水性），不同的方法可能需要额外的控制来优化液滴的泄漏。总之，我们成功开发了一种多功能且高效的微流控系统，用于封装真菌的单个孢子，然后对液滴进行抗真菌分析。

微流控PDMS芯片制造和单孢子封装

通过软光刻技术创建了微流控芯片。该芯片在AutoCAD 2018软件下设计（图5a），并由CAD/Art打印在光掩模上。在硅晶圆上制备SU8-2050负性光刻胶模具，通过紫外线照射和随后的显影（SU-8显影液）。将固化剂添加到PDMS基材至终浓度为10%（w/w），混合，倒入模具上。真空脱气后，将模具在65°C下孵育5小时。然后剥离PDMS，用活检打孔。PDMS的结构化面通过将两个部分暴露于配备Equinox的氧等离子体中，与玻璃显微镜载玻片结合。微流控芯片用Aquapel处理，然后用HFE-7500油处理。

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