首页 > 技术资讯 > 行业咨讯

微流控技术在病原体快速鉴定和药敏检测中的应用与面临的问题

目前临床微生物的检测以传统培养法为主,通过样本接种、培养,分离单菌落后,通过形态、生化反应或质谱鉴定菌种,进而通过纸片法、E-test或微量肉汤稀释法获得药敏结果。这种传统培养-鉴定-药敏的方式,虽然结果可靠,微生物实验室的“金标准”,但手工操作复杂、出结果时间长,人工成本和时间成本成为了微生物发展的重要制约因素。难以做到入院常规筛查病原体,易导致漏检,且感染患者也难以动态监测治疗效果;临床重症患者通常只能经验用药,在2-3天获得病原学依据后再按需调整抗生素,易导致用药无效、诱导耐药、过度医疗等情况,患者增加医疗花费,造成较大的社会和经济负担。

反观临床生化实验室,在20世纪80年代时也是手工单样本操作,但20世纪90年代以后,临床开始应用生化流水线,样本检测效率极速提升,出现了质的飞跃,大大促进了检验发展进程。而临床微生物领域的检测场景,目前仍需大量人力和时间,那么是否能如生化实验室一样,达到自动化检测水平?哪种检测技术具有病原体快速鉴定和药敏的优势?又能兼顾高敏感性和特异性?对于微生物检测而言,快检的主要关键问题在哪个环节?以上均是微生物实验室面临的挑战,也是需要回答的问题。

临床微生物实验室有哪些快速病原体鉴定和药敏的检测技术?微流控技术的优势是什么?  

理想的检测技术应包括几个层面:快速、精准、自动化、能够获得表型药敏等。在鉴定方面,目前微生物实验室可以进行快速病原体鉴定的技术,除传统方法外,还包括PCR、基于免疫的检测、荧光原位杂交、微流控芯片技术等。各方法的比较见下表1。

在药敏方面,近年出现了各类新兴的快速药敏检测方法,包括细菌纳米运动检测技术、流式细胞技术、表面增强的拉曼光谱法、单细胞形态分析技术、流式细胞分析法、DNA微阵列、多重芯片技术、PCR/real-time PCR、基因组测序等,见表2。但以上分子类的方法仅能检测药敏基因型,不能检测药敏表型,而基因型是否与表型一致,还需进一步验证;其他药敏表型的诊断技术,一般又需分离纯菌落测定,使检测时间延长。

综上比较,微流控技术不论在鉴定抑或药敏方面,均具有较明显的优势。可应用样本同时进行病原体的鉴定和表型药敏,可3h内完成测定;操作具有便捷性;目前该技术虽未完全实现自动化,但自动化已在发展进程中,也已出现了掌上微流控设备,达到一体化前处理、鉴定和药敏的目的。对于低浓度菌量的问题,通过微流控捕获使细菌富集,可达到体系检测阈值,具体在后文阐述。

图片1.png 

1微生物实验室快速病原体鉴定技术的比较

图片2.png 

2 微生物实验室快速病原体药敏技术的比较

微流控技术通过什么原理进行检测?

电化学微流控技术,应用生物传感器进行病原体检测。优势是结合“基因型+表型”共同特点,不需基因扩增,检测细菌16sr RNA鉴定病原体,拥有分子检测的敏感性和特异性;并监测表型药敏结果。检测原理是:样本NaOH前处理使细菌裂解后,病原体核酸释放,结合于包被了探针的检测芯片,通过特异性捕获探针-病原体16sr RNA-特异性检测探针组合,形成“三明治”结构,其中检测探针上标记了荧光素的辣根过氧化物酶,在TMB(电子介质)作用下,氧化还原H2O2(反应底物),生成电子,可产生电信号大小与病原体含量呈正比,实现定量检测,在电流检测装置中,1分钟即可读取电流信号值1(图1)。16通道芯片,可根据靶点设计不同探针,同时进行多重病原体的检测。由于检测过程无需经过扩增,使整体反应和检测时间大大缩短,将鉴定时间,由传统培养法的18 h缩短为1 h,且操作便捷。

图片3.png 

1 电化学微流控技术原理  

注:A图为检测芯片结构,芯片上包被各类细菌种属特异性捕获探针,与细菌16sr RNA、以及检测探针相结合,形成特异性捕获探针-16sr RNA-捕获探针复合物,即“三明治”结构。B图局部放大,显示此“三明治”结构在酶促底物作用下,生成电流,最终通过测定电流信号值大小,进行病原体种类和定量判断。

微流控技术为何能够获得表型药敏结果?

表型药敏是临床用于判断细菌耐药性的金标准,电化学微流控技术检测细菌16sr RNA,因16sr RNA是细菌生长复制活跃的标志,只有生长状态的细菌才能被识别检测,在该技术中呈现电流信号的变化。分析样本在抗生素作用下电流信号值的变化趋势,获得药敏结果。样本与待检测抗生素短时孵育,敏感菌株生长抑制、菌量减少;反之,耐药菌株的菌量呈增多的趋势。电流信号升高或降低的变化,即对应细菌生长或抑制趋势,明确细菌对药物的敏感性,检测的结果反应的是细菌表型生长特征。这类药敏检测兼具了16sr RNA探针基因的特异性,以及表型药敏的稳定性。

目前,电化学微流控体系也出现了荧光检测的整合平台,通过测定荧光信号强弱变化,明确表型药敏结果(图2)。通过荧光信号监测细菌生长,能够实现单细胞层面的药敏分析。

目前传统微生物药敏检测时间约为48 h,电化学微流控体系仅需短时与抗生素孵育后进行监测,不需分离纯培养物,可直接应用样本检测,将药敏时间缩短为3 h以内。

图片4.png 

2  快速细菌鉴定和表型药敏的电化学体系

该微流控体系可检测样本实现单细胞层面的鉴定,并且进行表型药敏。将样本滴加在微流控装置中,加入探针并与抗生素混合。结合细菌16sr RNA检测靶点,测定荧光信号的探测器分析。通过分析对应的荧光信号强弱的变化,明确抗生素敏感性。  

微流控体系为何具有高敏感性和高特异性?

对于生物传感器的识别元件,微流控体系中采用核酸适配体(即16sr RNA核酸探针,结合细菌的16sr RNA片段),生成电信号,通过检测电流值大小明确信号强度。相比其他生物传感器识别元件,如抗体、抗菌肽、生物小分子及化合物、凝集素、分子印迹聚合物等,核酸适配体具有更高的特异性。

电化学微流控方法是一种分子诊断技术,即将标记了荧光基团的线性探针直接和细菌16srRNA杂交,产生电流信号。由于一个细菌内部存在大量rRNA(约103-105个),即无需扩增,也能保证反应的敏感性,这也是该技术直接可应用临床样本,不需分离纯菌株,即可进行特异性病原体鉴定的原因;也解释了为何不经扩增,即可达到普通PCR反应检测的敏感性。

但由于RNA稳定性较差,为提高探针的稳定性,将核酸探针更换为肽核酸探针,后者指蛋白和核酸的杂合物,这类探针可与DNA或RNA分子形成稳定的杂交复合体,由于既不是纯核酸也不是纯蛋白,因此该复合物同时具有抑制核酸酶和蛋白酶降解的能力,并具有热稳定性,也可增加杂交率。探针经修饰改良后,微流控体系同时具备了敏感性、特异性和稳定性。

微流控技术的临床应用如何?鉴定和药敏结果是否可靠?

微流控技术直接应用临床样本,进行样本中病原体的鉴定和药敏。现在已应用的临床场景包括尿路感染,血流感染等。

在鉴定方面, 16通道的芯片,可针对检测靶点设计不同特异性探针,能够同时鉴定并定量。应用尿液样本,对临床常见的肠杆菌,非发酵菌,肠球菌等测定。以传统培养法作为标准方法,对微流控技术检测结果比较,分析其敏感性为89%,特异性达到100%。对尿液样本检测限达到104CFU/ml,达到临床对尿路感染的诊断标准。针对模拟血流感染样本,对肠杆菌、葡萄球菌、非发酵菌等,同样可以准确鉴定。并且电化学微流控在1h内,即可获得病原体鉴定结果。

在药敏方面,直接与抗生素混合进行电流值的测定。多通道芯片可混合不同种类的抗生素,通过电流值的动态监测,同时获得多种抗生素,如青霉素类、喹诺酮类、磺胺类等的药敏结果(图3、图4)。应用临床尿液样本,以微量肉汤稀释法为标准方法,分析电化学技术对药敏检测的准确度,每种抗生素的准确性均达到90%以上,重大错误率为4%,极重大错误率1%,基本符合微生物性能验证标准(其中仅重大错误率略高于3%的标准)。微流控技术应用临床样本,3h即可获得初步表型药敏结果。

图片5.png 

3  电化学微流控对尿液样本快速药敏的电流-时间变化趋势

患者尿液与抗生素作用后形成的电流信号值,在无抗生素(紫线)、氨苄西林(红线)、环丙沙星(绿线)和复方新诺明(蓝线)药物中生长曲线。每15 min检测1次大肠埃希菌16sr RNA,电化学微流控的快速药敏结果和临床传统方法VITEK2 板卡的结果一致。AMP氨苄西林,CIP环丙沙星,SXT复方新诺明。

图片6.png 

4  电化学微流控对临床尿液样本的快速初步药敏结果

尿路感染患者临床样本,应用电化学微流控系统,进行快速病原体鉴定和初步药敏。结果显示,该样本为大肠埃希菌阳性,且浓度约为105cfu/ml;常用抗生素中,头孢类抗生素敏感。整个过程在3h内完成。

NC阴性对照,EF粪肠球菌,EC大肠埃希菌,KP肺炎克雷伯菌,PA铜绿假单胞菌,PM奇异变形杆菌,EB肠杆菌目,UNI泛指所有细菌。

POS阳性对照,SXT复方新诺明,CIP环丙沙星,AMP氨苄西林,AXO头孢曲松,GEN庆大霉素,EFP头孢吡肟。

快速检测的关键环节和面临的问题是什么?微流控技术是如何解决的?

关键环节之一是对样本的前处理,微流控技术应用化学法,即溶菌酶和NaOH裂解样本中的病原体,在8min内达到释放核酸的目的。已应用在临床尿液样本,以及血液样本的检测,并分别明确了其适用性。

其次,对于复杂样本,需充分考虑基质的影响因素。如血液样本,存在复杂的基质效应和背景;尿液样本中的PH值范围差异较大,呼吸道样本的黏性高,等等。如应用芯片和生物传感器进行检测,需要避免基质对检测的影响。通过模拟血流样本,应用微流控检测多种细菌,包括大肠埃希菌,铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌等,通过分析电流信号值,明确对于全血的检测,背景值<25 nA,特异性靶点的检测,阳性阈值为100 nA,能够区分阳性信号,说明背景的基质效应,不影响微流控检测结果的判读。对于尿液检测,已通过100余例样本,明确敏感性89%、特异性100%,说明尿液PH值的差异性并非影响电流信号值的主要因素。

另外,对于菌量低的样本,如何富集细菌,达到技术的检测限也是难点之一。由于血液中菌量可低至1-10cfu/ml,而微流控装置测定菌量起始浓度范围是104-108CFU/ml,需通过前处理的富集,使检测限达到样本浓度的需求。对全血样本,通过葡聚糖沉淀红细胞,血浆再经离心,可20 min内快速富集血液中的细菌,达到即使血液中菌量浓度低至10cfu/ml,也可被微流控装置捕获,再次提高检测的敏感性。甚至通过微流控装置监测在抗生素作用下,单个细菌的生长状态,即可在1h左右即获得单细胞层面的表型药敏结果,使其能够达到血液感染样本低浓度菌量的检测需求(图5)。

图片7.png 

5   微流控技术监测单细胞层面的表型药敏

单个大肠埃希菌在微流控通道中,分别加入不同浓度的抗生素。红色箭头指向细菌所在位置,在低浓度氨苄西林(<2 µg/ml)作用下,细菌生长;高浓度(8 µg/ml)时,细菌裂解。比例尺5 µm。

微流控技术结合了“基因型+表型”的优势,即获得分子检测的敏感性,同时获得表型药敏。这种术既满足了临床对检测时间的要求(1h可获得鉴定结果,3小时可获得药敏);也满足了实验室对操作便捷的需求。可不经分离纯菌落,直接应用临床原始样本进行检测,将传统微生物鉴定时间,由18h缩短至1小时;将获得药敏的检测时间,由48 h缩短至3小时,且达到单细胞监测层面。拥有多通道的芯片体系,可多重检测,且逐步在实现自动化的检测进程中。微流控技术快速为临床提供病原学诊断依据,可提高临床诊治效率,降低血流感染患者病死率;同时通过减少不必要的抗生素花费,减少社会经济负担。未来可以充分发挥灵活设计的优势,继续探究该技术在真菌、分枝杆菌等其他病原体的检测的能力。

免责声明:文章来源网络  以传播知识、有益学习和研究为宗旨。 转载仅供参考学习及传递有用信息,版权归原作者所有,如侵犯权益,请联系删除。

 



标签:   微流控