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用于呼吸道病毒检测的微流体样品制备

用于制备临床样品的技术已经完善,可用于多种临床情况下的诊断测试,例如,提取,浓缩和纯化呼吸道病毒颗粒。这些技术可提供高纯度和高浓度的目标样品,但需要大量设备和训练有素的人员来进行,而在资源有限的环境中很难实现这一点,而快速检测和诊断对于正确处理呼吸道病毒至关重要。微流体已广泛用于资源受限的环境中的快速病毒检测,在这种环境中,大多数设备都专注于检测而不是样品制备。最初的微流体原型由于它们依赖于几个片外预处理步骤和外部实验室设备而受到阻碍。最近,样品制备方法也已被并入微流控技术中,以多合一的自动化方式进行病毒检测。在较小体积的样品和试剂中已证明了病毒的提取,浓缩和纯化,不需要专门的培训或复杂的设备。最近的设备显示出能够独立有效地运行以提供快速,自动化的样品制备以及高效检测病毒样品的能力。在这篇综述中,讨论了用于分离和纯化病毒样品的微流体样品制备方法,总结了当前系统的局限性,并确定了潜在的进展。在更少量的样品和试剂中,病毒的浓缩和纯化已得到证明,不需要专门的培训或复杂的设备。最近的设备显示出能够独立有效地运行以提供快速,自动化的样品制备以及高效检测病毒样品的能力。

介绍

呼吸道病毒遍布全球,感染人类的上呼吸道和下呼吸道,导致呼吸窘迫,,尤其是在儿童和老年人中。这些病毒的流行可以保持持久或季节性变化。总体而言,这些呼吸道病毒持续具有在全球范围内传播的潜力,如先前的暴发[2009 H1N1,严重急性呼吸道综合症(SARS)和中东呼吸综合症(MERS)]以及目前的2019年冠状病毒病(COVID- 19)大流行。对这些病毒的显着缓解、管理和治疗在很大程度上依赖于快速识别高危人群并测试感兴趣的生物样本中是否存在病毒的能力。通常,在没有实验室设备或训练有素的人员的情况下,在资源有限的环境中可以对这些样品进行快速而灵敏的检测。必须对这些生物学和临床样品进行处理,以产生高纯度的浓缩病毒。生物样品的收集方法以及所需的样品存储和处理步骤根据要检测的病毒和最适合检测病毒的样品基质而有所不同。

呼吸道病毒

有大量的呼吸道病毒。考虑到它们的致突变性和全球流行性,必须测试数百种血清型。这些病毒通常会引起呼吸窘迫和发烧症状,并导致发病,特别是在儿童和老年人中。在人类中最常见的病毒包括呼吸道合胞病毒(RSV),人副流感病毒(HPIV),人间质肺病毒(HMPV),人鼻病毒(HRV),冠状病毒,腺病毒,博卡病毒,肠病毒以及甲型和乙型流感。这些病毒不是唯一存在的呼吸道病毒,但它们涵盖了临床相关呼吸道病毒的最大范围。特别是2009年H1N1(新型A / H1N1流感;也称为猪流感),SARS(严重急性呼吸道综合症;由SARS冠状病毒或SARS-CoV引起),MERS(中东呼吸综合症;由MERS-冠状病毒或MERS引起) -CoV)和最近的COVID-19(2019年冠状病毒病;由SARS-CoV-2引起)已导致全球大流行,最初都没有适当的治疗选择或疫苗,而快速和低成本的检测是实现遏制这一目标的关键成功的。

临床样本

临床样品的生物学起源和时间大大影响了病毒的准确和早期检测。例如,并非所有病毒最初都会导致痰液的产生(咳嗽产生的粘液),因此拭子可能是必需的,尽管它们无法像其他采样方法一样深,例如吸气收集(收集样本)通过真空泵导管系统)。此外,病毒在体内整个孵育过程中,会在不同时间在不同区域积聚。由于这些原因,适当的测试需要通过各种方法(通过抽吸,拭子或自然回收手段)回收各种样品。从这些病毒中回收的临床样本来自鼻,鼻咽,喉(口咽),支气管肺泡,痰,粪便,脑脊髓液和血液成分,例如全血和血清。可以通过灌洗(洗涤),拭子,吸出物和静脉放血(撤针,尤其是抽血)来收集样品。这些可以在图1中以图形方式看到。

用于呼吸道病毒检测的微流体样品制备

1.(a)人体中显示的各种样本位置,包括鼻,鼻咽,口咽/喉咙和支气管肺泡。(b)灌洗:将导管放置在所需位置,通过撒药器冲洗盐水并收集流出物的支气管肺泡灌洗(BAL)的示例。(c)抽吸是通过抽吸动力导管收集样品。鼻咽抽吸是一个例子。(d)如鼻拭子示例所示,将拭子插入该位置以收集

每种病毒可能使用不止一种收集方法。此外,需要在采集地点以外的地方进行处理的临床样品也必须置于病毒或通用运输介质中或冷藏保存(短期为2/8°C,长期为-70 / -80°C期限存储)。该处理步骤很重要,因为它可以保存病毒样品以备后用

呼吸道病毒

临床样本

检测方法

呼吸道合胞病毒(RSV)

鼻咽抽吸物

病毒培养

鼻咽拭子

荧光免疫测定

快速抗原测试(LFIA)

逆转录PCR

副流感病毒(HPIV)

咽拭子

逆转录PCR

支气管肺泡灌洗

鼻咽抽吸物

人类偏肺病毒(HMPV)

鼻咽抽吸物

逆转录PCR

咽拭子

病毒培养

支气管肺泡灌洗

鼻病毒(HRV)

鼻咽拭子

逆转录PCR

病毒培养

DNA测序

冠状病毒

鼻腔抽吸

病毒培养

鼻洗

逆转录PCR

鼻咽拭子

荧光免疫测定

支气管肺泡灌洗

腺病毒

咽拭子

病毒培养

喉咙清洗

ELISA法

逆转录PCR

血清

粪便

博卡病毒

鼻咽拭子

逆转录PCR

鼻咽抽吸物

病毒培养

鼻咽冲洗

粪便

肠病毒

粪便

逆转录PCR

鼻咽拭子

口/鼻囊

脑脊髓液

甲型和乙型流感

洗喉

逆转录PCR

鼻拭子

DNA微阵列

咽拭子

鼻咽拭子和吸

微流控纯化和提取方法

微流控技术和芯片实验室(LOC)设备已实现了更高通量的病毒样品纯化,这通常是自动化的,并且需要更少量的起始临床样品。微流控装置使用各种原理从生物基质中提取,纯化和浓缩病毒样品。这些技术可大致分为(1)基于磁珠,(2)基于液滴,(3)基于结构(4)基于流体特性的方法。这些方法的分类基于导致病毒样品捕获的主要成分。

基于粒子的方法

基于粒子的方法涉及向临床样品中添加抗体包被的,生物素化的或其他功能化的千分尺或亚微米级颗粒,以从各种临床样品中捕获目标病毒。可以将这些珠子离心以将其从溶液中除去,因为它们的大小和密度都比未结合的病毒大,或者可以通过使用膜过滤来分离,而剩下的废物则可以流出。在微流体平台上很难实现离心分离,因为这需要更复杂的微流体设计,在某些情况下是由外部设备执行的

其他基于粒子的方法依赖于磁性功能化粒子从临床样品中过滤出病毒样品。这些磁珠不需要离心,因为系统中的外部磁场作用于它们,将其从溶液中去除。外部磁场由放置在含有微珠的反应室上方的磁体感应。该方法可以很容易地在微流体装置上实施。微流体室的大小,溶液的流速和反应体积取决于所施加磁场的强度。为了易于使用,这些磁体产生磁场通常是永久性的。

基于液滴的方法

为了将样品中的目标病原体分类以进行分析,开发了微滴微流控技术。通过用表面活性剂在油相中乳化包含病原体的水相,可以实现单细胞/细菌/病毒区室化。大量单分散的油包水液滴的产生频率为每秒〜1000个液滴。作为病原体和试剂在微液滴包封(直径约30  μ m和体积〜5 PL)中,浓度增加,以提高检测灵敏度。此外,通过使用液滴分离病原体,大多数随机分子和污染物可以封装在单独的液滴中。

用于呼吸道病毒检测的微流体样品制备

样品制备方法高度依赖于检测方法的选择。与通常用于微流体病毒检测的基于实验室的纯化方法相比,在单个微流体芯片中同时进行纯化和检测的同时演示肯定会增加制造复杂性并可能损害测定性能。微流控芯片中主要处理样品的纯化和提取方法PCR和等温扩增、基于抗体的免疫测定的荧光信号。基于免疫测定的方法包括电化学,荧光和光谱/比色检测。

尽管基于粒子的方法在过去由于试剂和规程的更多标准/跨平台可用性而变得越来越流行,但基于液滴的方法却因其能够以非常小的体积执行多重实验并提高了灵敏度而变得越来越受欢迎。基于结构的方法在芯片设计和易用性方面存在局限性,尽管该方法已显示出巨大的实用性,并且必须进一步探索以克服这些限制。基于扩增的样品检测在很大程度上很流行,因为RT-PCR可用于非常早地检测病毒颗粒。基于光谱/比色检测的方法还受到不完善的样品制备方法留下的废物的严重影响。这些方法因其易用性,敏感性和特异性而具有巨大的潜力,但在完善样品制备模块方面还需要做更多的工作。值得注意的是,很少有将电化学检测与微流体样品制备模块结合在芯片上的例子。这可能部分是由于归因于样品废物和其他因素的准确性问题引起的,但应进一步研究。总体而言,可以看出,片上病毒检测方法与样品制备模块的结合可能有几个重要的发展领域。

微流控设备的最新进展为开发需要更小,临床相关样本量的高效提取系统打开了大门。适当的样品纯化,浓缩和完整的样品制备可为资源贫乏的环境提供可用方案,以解决呼吸道病毒的出现。当前,这些设备仍以可变的高效捕获机制和复杂的设备制造形式面临挑战,然而,新颖方法的发现以及将这些样品制备方法与快速新颖的检测方法结合起来的进一步发展将使更完整的样品能够应对目前缺少用于呼吸道病毒的即时护理设备的设备。

文章节选自文献:https://doi.org/10.1063/5.0041089

Microfluidic sample preparation for respiratory virus detection: A review


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