基于微流控芯片的30种皮肤型HPV分型检测研究
人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是一组双链DNA病毒，属多瘤空泡病毒科，约由8000个碱基对构成。目前已有超过200种HPV型别，并且各项研究不断的发现新的HPV型别。HPV与多种皮肤黏膜疾病相关，其中包括良性和恶性的增生病变皮肤型HPV大部分为Beta属，小部分属Alpha属、Gamma属、Mu属和Nu属。可引起数种皮肤型疾病，例如良性皮肤疣，日光性角化病(AKs)和非黑素瘤皮肤癌(NMSCs)。在健康人的皮肤上也常常检出皮肤HPV型别。皮肤型HPV感染中最常见的疾病即为皮肤疣类疾病，可分为寻常疣、跖疣和扁平疣这三大类，不同的HPV型别感染可导致不同的皮肤疣疾病的发生。寻常疣多由HPVl、2、4型感染引起，HPV2型别可能是引起人群手、足寻常疣的最常见型别。扁平疣则多由HPV3、10、28引起。且不同的HPV型别引起的皮肤疣临床表现都略有不同，例如角化程度的不同。且HPV的感染具有显著的地域差异，通过对本地区患者HPV感染型别的检测，结合对治疗效果的分析，从而对推动皮肤疣个体化治疗方案的实施提供分子流行病学依据。但是目前绝大部分的HPV检测方法是针对黏膜型HPV，缺乏一种成熟的可应用于临床的皮肤型HPV检测方法。
环介导等温扩增技术(LAMP)是一种可在恒温条件下扩增DNA的技术，反应过程为4套特异性引物特异性结合目标DNA的6个位点，并由BstDNA聚合酶催化自动扩增链置换DNA。该技术有着耗时少、花费低以及不需专业仪器等优点，与其他DNA扩增方法相比，有着明显的优势。也因此，LAMP技术常作为一个低成本基因分析工具被用于资源贫乏地区。LAMP方法的敏感性并不会因为样本中非目标DNA的存在而受到影响，因此该方法的应用范围也较PCR更为广泛。更为突出的优势是，它的敏感性与特异性均要高于PCR很爹，由于LAMP反应中引物必须结合目标DNA的6个特异性位点，该方法的特异性会明显的高于其他检测方法。LAMP反应的结果判定也十分方便。在LAMP反应过程中dNTP可释放大量的焦磷酸盐离子，可与反应缓冲液中的镁离子结合，形成白色沉淀。当大量的白色沉淀形成后即可肉眼观测反应结果。在本研究中将采用加入羟基萘酚蓝(HNB)进行比色检测，HNB作为指示剂直接加入LAMP反应液中与M92+结合，使反应液呈现紫色。在反应过程中，由于大量不溶性焦磷酸镁盐的产生，导致了溶液中M92+的大量减少，溶液的颜色由紫色变为了天蓝色。由于这种方法观测结果更为快速简便，也已经被大量运用。
LAMP已经作为一个方便快速准确的核酸扩增方法己被广泛运用于病原检测，如人类免疫缺陷病毒、急性呼吸系统综合征冠状病毒、乙肝病毒和H5禽流感病毒等。相较于其他的病原检测方法来说，LAMP技术要准确和快捷许多，但是大多数的LAMP检测方法仍是在聚丙烯试管中进行，反应过程需要数十至数百微升体积的溶液，这限制了LAMP反应的批量化和微量化，并不利于构建完整的诊断体系。同时由于LAMP反应的高灵敏性，也导致了假阳性率的增高，这也成为了LAMP技术应用于病原检测的一个待解决问题。
现微流控技术已经应用于芯片实验室(1ab—on-chip)系统中，所构成的微流控芯片可以达到在毛细通道中操控微量溶液反应，可以在一张芯片中同时做到反应、检测和结果判定，构成一个高通量、低成本的密封反应体系。将LAMP技术与微流控芯片相结合，即可得到一个微量的LAMP反应体系，同时密封的反应体系也大大降低了假阳性率，促进即时(POC)病原检测系统建立的实王见。
本研究旨在将LAMP反应与微流控芯片技术相结合，满足临床中对皮肤型HPV的分型检测需要，研究出一种实用、准确、特异及灵敏的皮肤型HPV检测方法。
主要仪器
(1) ABIStepOnerealtimePCR仪
(2)水浴锅
(3)平板式扫描仪
(4)天能4100凝胶图像分析系统
主要试剂
(1) LAMP试剂一NewEnglandBioLabs其中包括：①Bst2．0DNA聚合酶，⑦10xThermoPolreactionbuffer
(2) PCR试剂一TaKaRa公司其中包括：(DpfuDNA聚合酶(2．5U)⑦dNTP③10xpfuBuffer④SYBRGreenI
(3) 标准病毒核酸、引物合成及PCR结果测序均由华大基因提供
实验方法
1构建以微流控技术及LAMP反应为基础的HPV检测方法
(1) 于http://primerexplorer.html在线LAMP引物设计网站进行HPV特异性引物的设计，每型别各设计四组引物，对四组引物分别在离心管中进行扩增反应，反应体系为25ul，分别为内引物FIP和BIP各1．6laM，外引物F3和B3各0．2uM，dNTP1．4uM，SYBRGreenI1201．tM，BstDNA聚合酶8U，MgS048mM，10xThermoPolreactionbufie(10mMKCl，IOmM(NH4)2804，20mMTris．HCl，0．1％吐温20，0．8M甜菜碱)，lng标准病毒核酸DNA(以下简称为质粒DNA)。同时设置四组阴性对照，将上述反应体系中质粒DNA用ddH20代替。将离心管放入荧光PCR中反应，设置温度为60℃，反应60min。观察每组引物的扩增效率，筛选扩增效率较好的引物。
(2) 检测30种HPV型别相互间特异性，实验用微流控芯片有8个反应孔，每一实验均有阳性对照组以及至少一个阴性对照组，将30个型别按照高危型和低危型分为皮肤低危型别组、皮肤高危型别组及皮肤罕见型别组，每6个型别为一小组，皮肤低危型别组由3个小组组成，皮肤高危型别及皮肤罕见型别各1个小组(见表1)，特异性验证在各组内进行，保证每小组内各HPV型别之间特异性较好的基础上，尽量保证小组组间特异性，并将小组组间交叉反应型别控制到最小。首先在利用离心管进行LAMP反应，筛选特异性佳的引物，反应体系为25ul，除了用HNB取代SYBRGreenI之外，反应体系同上，水浴60℃反应60min，直接观测颜色变化判断试验结果，阳性结果为天蓝色，阴性结果为紫罗兰色。30种HPV型别引物筛选完成后，在微流控芯片中重复试验，验证结果，芯片中加入待验证型别引物O．8ul，阳性对照组为反应体系中的质粒HPV型别引物，阴性对照组为空，自然风干后，注入无引物LAMP反应液(751．1l，反应体系同上)，水浴60。C反应60min，直接观测颜色变化判断试验结果，阳性结果为天蓝色，阴性结果为紫罗兰色。
表130种HPV型别具体分组
(3) 检测各型别引物的灵敏性，将各型别HPVDNA质粒溶液分级稀释为108copies／lal，107copies／ul，106copies／lal。使用微流控芯片进行实验，芯片中加入6种待验证型别引物0．8ul，剩余两孔为空，设置为阴性对照组，注入无引物LAMP反应液，反应体系为75ul，体系中加入待检测的6种HPV型别质粒DNA各3ng，其余同上，60。C水浴反应60min，直接观察颜色判断试验结果，阳性结果为天蓝色，阴性结果为紫罗兰色。
2评价新构建HPV检测体系
(1) 使用新构建方法检测皮肤疣临床样本型别。样本来自中国医科大学附属第一医院皮肤科门诊皮肤疣病人，使用低危型别组芯片进行检测，LAMP反应体系中加入临床样本DNA3ng，反应体系同上，60。C水浴反应60min，直接观察颜色判断试验结果，阳性结果为天蓝色，阴性结果为紫罗兰色。
(2) 使用PCR方法检测同一批临床样本HPV型别，使用皮肤型HPV通用引物FAP6085／64，反应体系为25ul，分别为10×pfuBuffer2．5ul，dNTP0．2laM，pfuDNA聚合酶5U，FAP6085／64引物溶液各6．4mM，质粒DNA2ng，PCR条件：95。C预加热5min之后，94。C保持50s，49。C保持50s，72。C保持50s，进行60个循环。将PCR产物加入10％琼脂糖凝胶中进行电泳分析，并将剩余PCR产物送出测序，测序结果经BLAST比对后，确定HPV具体型别。
(3) )将两种检测方法结果进行比对，以PCR测序法作为黄金标准，评价新构建的检测方法的特异性和灵敏性。
结果
1．引物筛选
每HPV型别各设计4组引物，选取在30个循环数内扩增且无非特异性扩增的引物进入下一步的特异性检测(如图1)，筛选结果示各型别均有多组引物符合引物筛选要求。
图1HPVl引物扩增曲线
图中1线代表HPVl型别第一组引物扩增曲线。2线代表HPVI型别第二组引物扩增曲线。3线代表HPVl型别第三组引物扩增曲线。4线代表HPVI型别第四组引物扩增曲线。5线代表无质粒DNA的阴性对照组。
2．特异性检测
5个小组组内HPV型别均无交叉反应出现，特异性佳(见图，2、3、4)，皮肤低危型别中3个小组间特异性检测结果(见图5)，其中HPV2引物可被HPV3质粒DNA扩增，HPV3引物可被HPVl25质粒DNA扩增，HPV75引物可被HPV76质粒DNA所扩增(见表2)，其余皮肤低危组HPV型别小组间均无交叉反应，特应性佳。
图2皮肤低危型别中3小组组内特异性检测
图5皮肤低危型别中3小组组问特异性检测
图中A代表l小组与2、3小组间特异性检测，B代表2小组与l、3小组问特异性检舅，C代表3小组与l、2小组问特异性检测。
表2皮肤低危型别组内出现交叉反应的HPV型别
3.灵敏性检测
30种HPV型别引物均在质粒DNA溶液浓度为107copies／ill时产生扩增反应，出现阳性结果(见图6、7、8)，可以得出该检测体系的灵敏性为可检测的病毒DNA浓度最低达107copies]lil．具体引物序列见表3．
图6皮肤低危型别组3个小组I-IPV型别灵t性检舅
圈中A代表I小组灵t性检测，B代衰2小组灵t性检测．C代衰3小姐更t性检一。
图7皮肤高危型别组HPV型别灵敏性检测
图8皮肤罕见型别组I-IPV型别灵敏性检测
本检测方法操作简单，不需专业技术人员即可操作，需要的仪器简单，普通水浴锅即可，加上微流控反应体系和高通量反应的特点，大大降低了临床检测的成本，节约了临床检测时间，短时间内(60min)即可目测出结果，且检测的灵敏性及特异性均高，可进行临床大规模样本检测，同时适用于研究HPV感染的流行病学和正常人的HPV感染筛查。本课题只检测了85例临床样本，仍需大量临床样本检测数据，完善数据分析，结合临床上治疗方法的治疗效果，分析各治疗方法对感染不同HPV型别的病例的治疗效果，从而达到精准医疗的目的，同时通过检测HPV感染型别的具体类型，可辅助判断疾病的良恶性，对疾病的诊断及预后判断有着极大的帮助，另一方面，通过对本地区的HPV感染的流行病学调查，为研制特异性的HPV病毒基因预防性疫苗提供了可靠的分子流行病学依据。
本课题新构建的皮肤型HPV检测体系初步构建完成，该体系具有高灵敏性及高特异性的特点，结合其低成本、高通量及操作快速简单的特点，满足了临床检测的需要，弥补了皮肤型HPV检测这一领域的空白。
（文章来源：中国医科大学作者葛格节选部分文章转载仅供参考学习及传递有用信息，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除）