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液滴微流控PCR的应用

液滴微流控PCR在技术方面的迅速发展已经证明了该技术的优越性并被广泛地应用于生物、化学等领域,尤其在单分子放大和分析方面的优势更加明显。在此,我们将主要介绍该技术在三个重要科学领域的应用。

一、高通量筛选

    近几十年来,生物学家一直致力于开发高通量筛选的各种技术,以及从较大的文库中获得更多功能性的基因和蛋白。其中一种特别的技术是指数富集配体系统进化技术(SELEX),通过筛选获得针对靶标具有高结合力和高选择性的DNA或RNA的核酸适配体。但SELEX耗时费力、低效且昂贵。

为了解决上述问题,发展了一种基于琼脂糖液滴微流控ePCR技术,直接从复杂的单链DNA文库中筛选核酸适配体。该种技术,针对癌症标志物Shp2蛋白进行筛选获得DNA富集文库被系统稀释并在芯片上被包裹进单个琼脂糖液滴中,使得每个液滴至多含有一条DNA序列,通过PCR进行放大扩增,产生单克隆的琼脂糖微球。DNA染色后,含有DNA的明亮微球被挑选出来。利用高通量的荧光流式细胞术,对单克隆微球中的单链DNA进行结合力表征。那些具有高结合力和特异性的单链DNA序列被挑选出来作为核酸适配体,或者被DNA测序,或者即可直接用于后续的生物医学实验。该方法还可以进一步推广应用其他分子进行技术,如mRNA展示、噬菌体展示等等。

二、下一代DNA测序

     DNA测序已被广泛地应用于诊断学、生物技术、法医生物学、生物信息学的领域。为了将DNA测序技术真正应用于人类日常的医学诊断和医疗保健,高准确性、长程连续性、高通量及低成本依旧是必须解决的问题,也是科学家发展下一代测序技术的主要目标。其中,消除传统的克隆技术DNA文库准备法是下一代测序发展的首要解决问题。后来发展了一种高通量的SCGA技术,并证明了它在DNA测序方面的应用。芯片上可以很容易地产生一种高通量的SCGA技术,并证明了它在DNA测序方面的应用。与BEAMing技术中小磁珠和小液滴相比,大磁珠具有更大的表面积可以标记上足够多的正向引物,同时反向引物等其他PCR试剂的含量也达到10倍过量,保证了PCR的效率。

    三、稀有突变的定量灵敏检测

基因改变,例如删除、定点突变和重组等,在癌症的发生和发展中起着重要的作用,也被认为是癌症诊断中的生物标记物。肿瘤细胞中的突变是细胞释放到血液、淋巴和尿液中,就要求这些突变的检测常常要在大量正常细胞释放的非突变DNA的高背景下进行。因此,一种能够利用临床样品,进行简单、高灵敏、定量检测突变型和野生型比例的方法是非常必要的。

针对这些低频基因突变的检测,为获得统计学上有意义的数据,必须进行高通量的分析。利用高通量微乳产生阵列定量检测致病菌。磁珠表面被标记上了针对不同基因的多种正向引物用于液滴PCR。最终通过实验得出,当使用96管道的MEGA时,5分钟内即可产生包含104细胞量的液滴。最终,该方法的检测限达到3/105,准确度高99%。这些结果证明了高通量的微流控平台可以在复杂体系中实现单分子和单细胞水平的定量基因型研究。

另一种液滴微流控PCR方法,应用于高背景下的灵敏定量检测突变DNA。后来设计了另一种液滴数字PCR体系,并证明了在10万个野生型基因背景下的单个突变型灵敏检测。他们更进一步提出了在血浆中的循环DNA的绝对定量检测方法。因此,这些高灵敏度的定量方法还可被应用于其他复杂体系的检测,如传染病的检测、等位基因的鉴定、基因翻译的分析等等。


 微流控

       液滴微流控技术极大地改变了传统的PCR技术,尤其是在单分子DNA扩增放大方面。微流控技术保证了对液滴尺寸和组分的严格控制,也可以独立地对每一个液滴进行混合、传递、和分析等操作。其次,由于在微尺度上的高比表面积,液滴可以减少热量和物质传递的时间,加快PCR反应,有利于快速的医学诊断和野外检测。再次,作为载体的邮相可以很好地阻断液滴内样品与管道壁的接触,避免了液滴间的交叉污染、模板损失和PCR偏好。此外,一次试验中能快速地产生大量均匀相同的液滴,从而可在短时间内完成大规模的平行实验和反应,并具有很好的重现性和单分子定量分析的能力。虽然液滴微流控PCR的发展和应用还刚刚起步,它已经在单分子PCR放大方面展现出了巨大的潜能,未来应向着更为精巧和多功能的方向发展,例如系统的集成、装置的设计优化、装置的制造、以及系统的自动化等。



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