微流控技术在生物医学领域的应用

1.细胞培养  

人类对细胞的结构、组成和功能的了解，绝大多数是建立在大量细胞的系综平均结果基础上的。然而，许多生命现象无法简单地从系综平均上得以理解和阐明，少量细胞乃至单个细胞层次上进行生命科学的研究尤为重要。绝大多数细胞的大小位于微米尺度，与微流控芯片中的通道大小相适应，为操纵少数或者单个细胞提供了极为便捷的条件。微流控芯片是新一代细胞研究的重要平台。微流控芯片所具有的不同操作单元技术灵活组合、整体可控和规模集成的特点在用于细胞研究的过程中主要表现为以下几个方面：

① 芯片通道尺寸（通常10 ～ 100 μm）与典型哺乳类细胞直径大小（10 ～ 20 μm）相匹配，利于单细胞的操纵和分析；

② 芯片的多维网络结构形成相对封闭的环境， 与生理状态下细胞的空间特征接近；

③ 芯片通道微尺度下传热及传质较快，可提供有利的细胞研究环境；

④ 芯片可满足高通量细胞分析的需要, 有可能同时获取大量的生物学信息；

⑤ 芯片的多种单元技术的灵活组合使集成化的细胞系统研究成为可能，细胞进样、培养、分选、裂解和分离检测等过程都可在芯片上完成。在芯片细胞培养中，PDMS是采用较多的一种芯片材料，该类材料具有良好的生物相容性，对气体有一定的通透性，有利于细胞培养过程中O2和CO2的气体交换。  

制造能为生物学研究者乐于接受和易于使用的芯片装置，是微流控芯片发展的一个重要方面。威斯康辛大学的Beebe研究组发明了一种细胞培养芯片。他们利用微通道两端开口处的表面张力差作为驱动力产生持续的流动，控制细胞和相应的溶液，还可利用层流效应来处理管道中的部分细胞。该芯片结合移液器，可进行高通量的细胞培养和实验。  

Quake等将微生物培养恒化器集成在微流控芯片上，使大肠杆菌的恒化培养的关键步骤（如洗涤、注入、恒化培养、循环泵流等）实现了自动化。在研究大肠杆菌的基因反馈回路的恒化培养时，发现该装置能维持几百个大肠杆菌的恒化培养长达几天。而在通常大容量体系中，杆菌因数量多会增加基因变异的概率，从而使菌落很快失去基因的自反馈调节。相对于传统方法，该芯片装置更适合长期进行的细菌恒化培养研究，而且具有单细胞水平的分辨率。  

哈佛大学的谢晓亮研究组利用微流控芯片技术结合β-半乳糖苷酶基因作为报告基因，应用单分子荧光技术将单个酵母和大肠杆菌细胞封闭在微流控芯片的微培养腔室中，研究了单个细胞中蛋白表达的随机性。芯片封闭了单个细菌细胞的微环境，既可使β-半乳糖苷酶催化生成的荧光产物迅速地被泵到细胞外，也可很快在微腔室中积累到足以被检测的浓度。因此微流控芯片从技术上弥补了传统生物学的不足，为细胞中随机过程的研究提供了很好的手段。  

微流控芯片可将各种细胞操作技术与电泳过程集成为一体，是实现细胞内（特别是单个细胞内）组分分析的重要技术平台。斯坦福大学的Zare研究组设计制作了一种多功能集成的单细胞分析芯片，在芯片中集成了单细胞的分离、操作、细胞裂解、荧光标记等功能单元，在管道下游用聚焦成线状的激光来激发单个分子的荧光并通过高灵敏度的CCD进行收集，计数并分析了单个细胞内极低拷贝数的蛋白质。该方法可对单个细胞中少于1000个的蛋白质分子进行计数，同时通过校正消除PDMS 材料自发荧光的影响。

2.PCR反应      

传统PCR反应包括变性（95℃），退火（65℃）和延伸（72℃）三个步骤，因此芯片至少应承受95℃的高温，而能在120℃条件下长时间使用的PC芯片成为热塑性聚合物微流控芯片的首选。在片PCR改善了热能传输，提高了热循环速度，加快了PCR反应速度，降低了昂贵试剂的消耗。含微混合器、阀、泵、微通道、反应室、加热器和DNA微阵列传感器在内的全集成PC芯片，可实现DNA样品的在片PCR扩增及扩增产物的检测。其中，生物样品（如血液）和免疫磁性捕获微珠溶液装入样品室，清洗缓冲液、PCR反应液、杂交缓冲液分别装在各自储存室内。在样品室内完成在片样品前处理，使血液中的目标细胞被免疫磁性微珠捕获及预浓集后，泵入PCR反应室，清洗缓冲液泵入PCR室，用于纯化捕获细胞。将PCR反应液引入PCR室，关闭反应室周围所有微阀，进行细胞热溶解和PCR反应。完成PCR反应后，打开微阀，杂交缓冲液将PCR产物带入检测室，与靶DNA发生杂交反应，产生电化学杂交信号及检测。

Soper SA等设计了含正方形微通道的PC芯片，用螺钉固定在加热装置上，正方形每一边放置可单独控温的加热块，加热块之间有一定的间隔，以保持各加热区的温度，减少加热区间温度的传递。PCR反应液采用电动连续流驱动的方式进入正方形通道，在通道各边依次加一定电压形成电动连续流，推动PCR样品塞沿正方形通道各边依次进行变性——退火——延伸——复性，完成PCR反应的一个循环。500 bp的目标DNA经27个PCR循环后，其产物被收集在一个液池中，采用PMMA芯片电泳激光诱导荧光检测，实现了目标DNA的在片PCR扩增。

3.基因结构与功能研究  

在DNA片段分析研究中，快速、高效和重现性是芯片DNA分析研究的方向和重点。采用简单的十字形PMMA微流控芯片，以低粘度的HPMC-50与多羟基聚合物为筛分介质，在有效分离通道长度仅为3.0 cm，场强300 V/cm的条件下，170s内电泳分离了DNA样品所有11个片段，其中271 bp和281 bp片段达到基线分离，快速、高效地实现了DNA片段的分离[23]。Kroutchinina N等采用紫外辐射改性的PC芯片高效、重现地分离了DNA片段。以2% HEC为筛分介质，分离通道长2.8 cm，在场强160 V/cm条件下，8 min内有效分离了100 bp DNA标准品所有11个片段。通过连续7次电泳分离DNA pGEM标准品，以676 bp片段峰计, 峰保留时间RSD为0.18%，峰高RSD为2.3%，表明PC芯片电泳分离DNA片段具有较好的可靠性。     

在特定基因序列中，碱基的错误插入或缺失会引起基因突变，使基因在结构和功能上发生改变，特定基因的突变常会引起某种遗传或基因疾病。长度多态性分析通过测定突变基因PCR产物片段长度的变化，检测由于碱基插入、缺失引起的基因突变。表面活性蛋白组（SP）B基因的突变会导致肺癌的发生。野生型SP-B基因片段的长度为600 bp，碱基插入引起的突变基因片段的长度为700 bp左右，碱基缺失引起的突变基因片段的长度为350 bp左右。Baba Y等采用10通道μ-CAE PMMA芯片进行铬中毒导致的肺癌患者SP-B基因片段长度多态性分析。在160s内同时分离测定了用于控制DNA萃取和PCR扩增的脱氢酶基因（300 bp，通道1和2）、野生型SP-B基因（通道5和6）、碱基缺失引起的突变基因（通道3和4）、碱基插入引起的突变基因（通道7）、患者的SP-B基因[野生型SP-B等位基因（600 bp）和碱基缺失引起的突变基因（355 bp），通道8；野生型SP-B等位基因（600 bp）和碱基插入引起的突变基因（716 bp），通道9]和100 bp DNA标准品（通道10）。多通道阵列芯片可快速、高效、高通量进行DNA片段分析，适用于大规模基因筛查、临床早期诊断。

由于基因野生型和突变型在PCR扩增过程中形成的同源双链和异源双链片段在变性温度上存在微小差异，通过温度梯度凝胶电泳可将其分离，进行基因突变检测。PC芯片集成微加热器和温度传感器，通过温度梯度凝胶电泳可实现在片基因突变检测。通过微加热器和温度传感器阵列对温度的控制，沿4 cm长的分离通道形成70℃至75℃的温度梯度。以4.5% PVP为筛分介质，在分离场强150 V/m条件下，电泳分离突变基因Mut100经PCR扩增后形成四种同源双链和异源双链片段。  

多层芯片制作技术结合大规模集成微阀、微泵和微腔室，可在PDMS芯片中完成从单细胞分选到mRNA逆转录成cDNA的基因表型分析。弗吉尼亚大学的Landers课题组发明了一种能够直接接受全血作为分析样品的集成微流控芯片。该芯片集成了样品前处理从全血中实现核酸的固相萃取、PCR 扩增和核酸电泳分析3个功能区域。各个区域之间以微阀分隔开来，最大程度地避免了上游操作对下游分析的污染。应用该芯片检测出750 nL被炭疽病毒感染的小鼠全血中的炭疽病毒DNA，且仅用1 μL鼻腔提取液确诊了一名患者体中的百日咳病毒。全部分析过程只用了不到30 min，展示了“样品进-结果出”（sample-in-answer-out）的全集成式微流控芯片的分析能力。

微流控芯片技术作为一种新兴的技术手段，已经从最初单纯的毛细管电泳的微型化技术，演变成为一种涵盖了从基础生物技术到生物医学诊断等各个领域的富有活力的工具性方法平台。随着微流控芯片技术的不断发展，微流控芯片技术与其他的代表性技术会在更为广泛的研究领域中交叉渗透，快速发展，而且也会更加直接地深入到人们的日常生活甚至平常使用的器件当中。阻碍微流控技术发展的瓶颈包括制造加工、集成度以及与宏观系统的接口等应用方面的问题。今后微流控芯片会朝着分析成分的多样化、制作基材的多样化、研究方法的多样化和系统的微型化与集成化的方向发展。集中在大规模、高通量、低消耗的生命科学和分析化学实验中，包括单细胞培养与分析、干细胞操控与培养、单分子生物物理学、高通量的细胞与分子生物学筛选实验、药物发现、高通量合成生物学、高通量测序技术、单细胞基因组学等。

汶颢微流控技术公司提供基于微流控的生物芯片、基因芯片、细胞芯片。