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法医学技术DNA快速检验在全世界进展?

1247年(我国南宋理宗淳祜七年),时任湖南提点刑狱兼大使行府参议官的宋慈编写完结《洗冤集录》,这是世界历史上第一本以逝世方法体系修改的法医学作品。

宋慈洗冤集录

《洗冤集录》开头曰:“事莫大于人命,罪大莫于死刑,杀人者抵法故无恕,施刑失当心则难安,故成指定狱全凭死伤检验。倘检验不真,死者之冤未雪,生者之冤又成,因一命而杀两命数命,仇报相循惨何底止。”故法医最重要的工作便是提供医学上的证据,协助检察官、办案者找出司法案件的真相,还原事实,保障死伤者的人权。

在现代,随着科学技能的开展,法医学已经成为一个复杂的开放系统,积极地吸收着来自数学、物理学、化学、生物学、心理学以及计算机科学与工程的常识,集现代科学技能体系于大成。特别是DNA检测技术的开展和应用,为法医学带来了一场技能革命。

DNA检测技术

1985年英国Leicester大学遗传学部教授A.J.Jeff reys发现并建立了DNA指纹图的查验办法,于当年成功地判定了一宗英国移民纠纷案件。经过对遗传物质DNA的序列多态性及长度多态性的查验,即可实现个别辨认及亲权判定,该技术正在成为当前法医证据判定最主要的技术手段,被广泛地运用于刑事犯罪侦办和亲权争议处理。

《中国测试》20177月刊发的《法医DNA快速查验研究进展》,为国家重点研发课题和公安部技能研究方案项目内容,就国内外法医DNA-STR快速查验的研究进展和效果,别离从快速提取、快速扩增、快速设备、快速试剂与快速设备相结合四大方面临有关DNA快速查验概略的技能办法和试验原理进行了充分说明和举例证明,并对该行业在快速查验办法的挑选提出清晰的建议。

法医DNA快速查验技能是目前研讨的热门,首要应用于个体识别和亲子鉴定范畴。该文分别从快速提取,快速扩增,快速设备,微流控芯片,全自动DNA分型检测设备方面临现有DNA快速查验的技术方法,试验原理进行充分说明和举例论证,一起对该行业在快速查验办法的挑选问题上提出明确的主张——选用强抑制力的缓冲系统,高效酶并结合快速扩增程序完成快速PCR检测技术,一起提出芯片化DNA检测的完成方法,指出国产的便携式全自动快速检测仪器是未来开展的首要方向。

微流控芯片技术又称微全分析系统(miniaturized total analytical system,μTAS),是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上,自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力,已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。近年来诸多学者基于微流控芯片技术的角度,对涉及快速检验芯片DNA提取、芯片PCR扩增、毛细管芯片电泳及集成式芯片均进行了深入的研究。

在芯片DNA提取技术方面,国内研究最多的是以二氧化硅微球为载体的固相提取,它是M48磁珠法和硅珠法提取DNA的微型化。原理如下:以二氧化硅微球、磁性微球等介质作为DNA的固相载体,首先采用高离子盐液进行DNA吸附、有机溶剂洗脱,最后使用低离子缓冲液洗脱DNA。如2010Duarte[21]报道了基于固相萃取原理的玻璃材质DNA提取芯片,如图 1所示,腔室的大小1.5 cm×1.4 mm×200 μm,以确保预提取的DNA溶液量恒定;在磁场作用下整个腔室充满磁性微球和盐酸胍(GuHCl),整个装置完成DNA的提取和纯化。Cady[22]也报道了基于固相萃取原理的DNA提取芯片,硅珠、sol-gel等固相载体填充于芯片中,实现了血样等的DNA提纯。陈兴等[23]验证了在多孔氧化硅芯片和普通芯片上进行DNA提取实验,多孔氧化硅芯片提取DNA的效率更高。目前各种聚合物基底如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)等由于价格低廉、加工方便已经被成功用于DNA提取系统。如2007年刘惯超等[24]制作的塑料基(PMMA)的DNA提取芯片表明:经过溶胶涂渍、在内表面制作二氧化硅层的芯片能够实现从血液中提取DNA。王聿佶等[25]采用PDMS(聚二甲基硅氧烷)芯片,能对生物样品中的DNA进行有效快速提取,并且在30 min内完成PCR产物的提纯。国外还有报道基于pH诱导的静电吸附DNA提取,基于UV活化的聚碳酸酯表面的DNA提取[26],基于纳米多孔过滤膜的DNA提取。

芯片PCR扩增与普通PCR扩增仪相比,扩增速度有明显优势。普通台式PCR扩增仪的产物扩增管升降温度总是远远滞后于扩增仪腔本身的温度,而芯片PCR则具有明显优势。Heidi Giese报导对比普通台式PCR仪器和微流控芯片使用SpeedSTAR试剂对样本进行扩增,普通台式PCR仪器扩增所用时间为145.1 min,芯片PCR的扩增所用时间为19.6 min,远远快于普通台式PCR仪器。采用升降温速率性能佳的PCR扩增仪可以明显缩短PCR的扩增时间,同样,提高芯片温度控制是实现芯片PCR快速扩增的关键,代表性的研究有Hagan等以非接触的红外加热方式进行热循环扩增,结合SpeedSTARTDNA聚合酶,仅在45 min内完成就完成了16STR位点在微芯片上的扩增。Mathies小组[30]则以接触式温度控制方式实现芯片上PCR的快速扩增,同时证明了芯片PCR-CE的可行性。此外微机电技术和温度传感器等方面的研究也证明了可以缩短芯片PCR扩增时间。

普通台式PCR仪器与芯片PCR的扩增对比

普通台式PCR仪器与芯片PCR的扩增对比

芯片毛细管电泳具有进样量少,灵敏度高,分析速度快等特点,非常适合法医DNA-STR的快速检验。毛细管电泳芯片由于尺寸小,可施加较大场强,所以在几秒钟内就可完成对样品的分离,微阵列毛细管电泳芯片可实现高通量检测则成为目前学者研究的热点。2002Emrich CA[31]报道的将高通量384孔毛细管阵列微电泳芯片集成在半径仅为8 cm的圆盘上,7 min内实现了同时对384份样品的检测;2006Yeung等制作的高通量96孔毛细管阵列微电泳芯片可在30 min内同时实现96个样本检验,这些均进一步显示了微芯片技术在DNA-STR快速分析方面的巨大潜力和优势。为了防止样品间发生交叉污染,降低成本,可以构建一次性的塑料材质的微整列电泳平台。

集成式芯片是当前微流控芯片研究的核心,如Hagan[29]DNA提取和RCR扩增集于一块芯片上,通过采用固相提取,使用快速启动DNA聚合酶及红外加热方式,在45 min内完成了口腔拭子的提取和PCR扩增;Roux[33]将芯片PCR扩增和电泳检测集成在一次性的塑料芯片上,通过非接触式红外加热方法仅在7 cm芯片上完成了电泳分离;季旭等[34]研制的一种集成PCR反应室与毛细管电泳CE的生物芯片,将硅片上制造的通过电阻加热的凹槽作为扩增池,在扩增池下游设计制造毛细管电泳系统,并通过紫外光等检测器判断结果,从而实现了样品扩增、电泳分离和紫外光检测的单片集成。Liu等将特定DNA模板的纯化、PCR扩增、进样以及电泳全集成于一张微流控芯片上,并可在3 h内实现对样本DNA的检验(如图 3所示),该全集成芯片原理结构为两个完全相同的分析系统在4 in1 in=2.54 cm)玻璃晶片上形成对称的双峰,每个分析系统包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)微泵和两个PDMS微型阀用于流体控制,首先通过4 cm长的珠捕获结构用于DNA分叉通道系统模板的捕获。图 3b)为加热器和电阻温度检测器(RTD),用于控制250 nL PCR室的扩增。图 3c)为500 mm长的双T通道锥形结构,用于控制PCR的纯化和进样,24 cm14 cm长的通道用于CE分离,同时这两个系统共享阳极、阴极,进一步节省了芯片的使用空间。文献[36]2014年将全集成芯片技术成功应用于对模拟犯罪现场样本检材的检验。全过程包括制备特殊酶的反应液用于DNA的提取,采用红外非接触式控温技术完成PCR扩增和高分辨的电泳分离方法在2 h内完成了对样本的准确分型,并与传统方法分型结构一致。

DNA芯片-全集成芯片原理结构

全集成芯片原理结构

1.微流控芯片DNA提取条件的优化

对提取进液量进行筛选,包括提取过程中的水,NaOHHCL以及最后冲洗的水和TE缓冲液的体积,通过控制变量法,分别设置不同的体积梯度和停留时间,进行自动化提取,按照正常的扩增体系,并同时设置阳性对照和空白对照进行比较确定出最佳进液量;对于提取进液的管道可以设置多种不同的长度并运行自动化提取流程,提取后取出芯片上的载体物质进行常规的PCR扩增并检测,通过比较不同长度管道的扩增效果确定出最佳管道长度。

2.微流控芯片PCR扩增与优化

对芯片PCR材料进行生物相容性验证是芯片PCR正常扩增的前提,因为一般芯片的结构是两种以上的材料通过键和组成,在此过程中可能会有抑制物释放出来从而影响后续的PCR扩增。直接将芯片的原材料剪取小块,放入扩增体系,加阳性标准品,扩增检测,同时设立不添加原材料的阳性对照,3个重复;分别用高温浸泡的芯片材料和去离子水配置PCR反应体系进行扩增检测,同时设置正常去离子水为阳性对照,3个重复;用去离子水冲洗键合芯片材料3次,配置PCR反应体系进行扩增检测,同时设置正常去离子水为阳性对照,3个重复;对提取装置最后的冲洗水进行研究,配置PCR反应体系进行扩增检测,同时设置正常去离子水为阳性对照,3个重复,对以上结果进行比较,如果荧光信号基本无差异则相容性良好。

微流控芯片PCR的实现重点在于对芯片材料属性的研究和芯片扩增体系的优化两部分。首先了解芯片的基本结构,一般芯片腔室的实际温度和PCR扩增仪显示的温度有较大差别,所以需进行芯片温度校准,以保证规定时间内有足够的退火温度和延伸时间;由于芯片材料的不同,即使对芯片PCR没有抑制作用,但是由于芯片比表面系数的增加,对蛋白酶的吸附逐渐增加,以及载体的存在,吸附会更明显,所以通常对芯片进行预处理,使内壁和反应体系隔绝,可以采用一定浓度的BSAPEG进行芯片涂布预处理。微流控芯片对PCR某些成分的吸附,会影响PCR的扩增效果,通过对扩增体系中不同反应液的分析和浓度调节,尽量改善扩增效果。采用控制变量法,分别对不同成分设置浓度梯度,进行扩增检测,并且同时设立常规检测进行比较;操作者可在扩增体系中加入不同浓度梯度的BSAPEG,并设立常规阳性对照,3个重复进行比较,从而确定出最佳扩增体系。

综上,缩短对样本DNA提取,扩增,纯化,电泳检测中任意环节所消耗的时间均可实现不同程度的法医DNA的快速检验。国内外成熟的方法是使用商品化的提取试剂,快速试剂,或是通过将快速试剂与性能好的快速扩增设备,电泳设备相结合来实现。但是本文认为直接PCR会因为样本中各种潜在的未知抑制物影响酶的活性,缺乏定量步骤会影响DNA的分型结果,所以使用商业化直扩试剂盒时,要严格按照试剂盒所规定的样本量进行实验。目前DNA-STR快速检验主要适用于常规检材,但对于一些疑难检材,混合样品,以及高度降解的检材的使用仍然是个严峻的挑战,但是要明确:快速检验的目的主要是协助公检法处理一些棘手和特殊的案件,如处理案件性质恶劣但必需在极其有限时间需要得到分型结果。虽然国外商业化的3种便携式的全自动快速检验仪器已经上市,但普遍存在的问题是检测成本过高,并且不能自主选择样本数,国内普及困难。全集成微流控芯片技术是目前快速检验研究的核心,即使芯片的适用具有一定的样本选择性,并且芯片结构复杂,成本高,但是国内的研究面临的主要瓶颈是如何开发配套的软件来分析自制的微芯片的电泳结果。法医DNA快速检验需从检测样本数目的自主选择、再检测样本能力以及疑难,混合样本的角度出发,研制出我国国产的便携式全自动快速检测仪器,并实现推广普及。





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手持式PDMS打孔器