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在离心式微流控芯片上进行单个细胞的捕获

概要:本文提出一种捕获单个细胞并对捕获到的单个细胞使用PCR进行特定基因测序的离心式微流控芯片;该装置在不需要微泵系统的运行下,采用5000rpm的离心力30s便可将细胞悬浮液中的细胞捕获到设计好的U型腔室中进行PCR扩增;
1. 离心式微流控芯片简介       

芯片结构如下图所示,该芯片直径 95mm,进液孔/出液孔 2mm,由 24 个微通道(宽:100um),每个通道集成 313 个 U 型微腔,即总共有 7512 个微腔(宽:300um、高:200um、深: 46um)组成,腔室之间间隔 200um(为辨别PCR产物的荧光图像),将1ul 含有细胞的 PCR 混合物在芯片上以 30s 5000 rpm 的速度流入微腔,一个微腔大约容纳1.5nL PCR混合物(1.5nl x 7512 = 11268nl),通道中多余的溶液通过离心力排出; 

微通道:从芯片中心到外围设计成曲折形;

目的:在无微泵情况下,通过采用离心力可驱动液体流动,尤其对同一方向不断施加离心力这种情景极其有力;

离心式微流控芯片 

2. DNA扩增与检测     

 本文在 U 型腔室中捕获到单个细胞后,立即对进液腔、出液腔进行密封,其目的为避免试剂挥发,同时保证 PCR 循环期间通道可以保持持续的湿润性;随后,将芯片放到定制PCR扩增仪器上, 热循环初始设置 95 摄氏度 2min 用于裂解捕获到的细胞;紧接着进行 PCR 扩增,其中 95 摄氏度 5s,55 摄氏度 10s,72 摄氏度 10s 循环 20-50次,每次循环后随机检测 20 个微腔中的荧光强度;最后扩增后的PCR产物通过特定装置进行分析;
3. 相关细节      

(1) . PCR扩增过程中的荧光标记采用特异性荧光标记 TaqMan,FAM探针;      

(2) 在用于PCR的普通微流体设备上,加热使得溶液蒸发导致通道中产生微气泡,干扰溶液的流动,是一个严重的问题;           

本文的解决办法如下:              

(a) 微腔中捕获到细胞后,对进液腔、出液腔密封;           

(b) 恰当的离心力;离心力过低,芯片外围的 U 型腔室捕获不到细胞;离心力过 高,U 型腔室底部的空气赶不出去;          

(3) 如何确保试剂分布到所有微通道中的微腔中?           

通过注入与试剂等体积的 dye solution,随后在荧光显微镜下观察;结果发现所有腔室中包含 dye solution 的比率大约为98.42 ±0.77%;       (4). 在普通定量PCR中,大多数情况下经过50个PCR循环后荧光强度达到饱和,因为当进行太多次PCR循环时,基因剂量中荧光强度的差异性便不能通过荧光饱和度来确定;鉴于上述情况,文章采取40次循环。本文每进行一次PCR循环便随机检测20个微腔中的荧光强度,荧光强度与PCR循环次数图如下所示;

Number of cycles 

S. enterica在芯片上的分布被认为是泊松分布,本文分析了细胞分离的效率与泊松分布之间的关系,并将理论值与实验值进行了比较。如下图所示;

细胞分离的效率与泊松分布之间的关系, 

参考文献:

Furutani S , Nagai H , Takamura Y , et al. Compact disk (CD)-shaped device forsingle cell isolation and PCR of a specific gene in the isolated cell[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010,398(7-8):2997-3004.

---尧灵---2019.09.26---调整---2020.6.8

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