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蛋白质检测

       蛋白提取

       蛋白样品提取是蛋白定量和分析的基础。天然蛋白质分子结构、化学性能各异,选择适当的细胞裂解液制备蛋白样品至关重要。选择细胞裂解液时,除了要考虑蛋白产量,还要考虑所选择的一抗的是否能识别线性的抗原表位。一些含有十二烷基硫酸钠(SDS)和强离子去污剂(如脱氧胆酸钠等)的蛋白质裂解液能够从组织或细胞中提取出大量的蛋白质,适用于PAGE,Western blot等检测;但由于这类裂解液易使蛋白变性,因而不适于免疫共沉淀(Co-IP)等实验。当使用某些只能识别非变性的抗原表位的抗体时,应该选择不含去垢剂或含有较温和的非离子去污剂(如NP-40,Triton X-100等)的裂解液,而不能使用含有SDS和强离子去垢剂的蛋白质裂解液。

       蛋白浓度测定

       确定蛋白样品浓度对许多实验都是至关重要的。通常大多数蛋白样品的浓度可以通过比色测定法定量。根据一些特殊化学试剂与蛋白质结合发生颜色变化的原理,使用分光光度计或酶标仪检测特定波长下的吸光值,通过与蛋白标准品进行比较,可以换算出样品中的蛋白含量。Bradford蛋白质定量试剂(Cat. No. E161-01)具有灵敏度高、简便快速、价格低廉的特点;BCA蛋白质定量试剂(Cat. No. E162-01)可提供更高的灵敏度和准确性,而且不受去垢剂的影响,更适宜微量蛋白的测定。

       蛋白质电泳和Western blot

       蛋白质电泳是分离、鉴定蛋白质分子量和浓度的重要方法,尤其是聚丙烯酰胺凝胶电泳(Po l yac r y lamide Ge l Electrophoresis,PAGE)。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺可聚合形成具有分子筛效应的网状结构聚合物,作为电泳时的固相支持物。进行非变性PAGE(Native PAGE)时,蛋白质在电泳过程中保持完整的状态,并依三种因素分开:分子量大小、形状和所带电荷。变性PAGE(SDS-PAGE)中,添加了作为变性剂和助溶剂的阴离子去垢剂SDS。SDS一方面可以打开蛋白质分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,消除蛋白质间形状上的差异;另一方面可以和解聚后的氨基酸侧链按比例结合,使得蛋白质-SDS复合物所带的负电荷大大超过蛋白质本身的电荷量,消除了蛋白质间的电荷差异。因此,在SDS-PAGE中,蛋白质在电场下的迁移速率只和其分子量大小相关。

 

附:其中有关Western blot 的介绍,欢迎查看网站英文版的介绍。


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