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数字化等温扩增技术(Digital LAMP)

数字核酸扩增和检测方法可提供出色的灵敏度和特异性,并可以对目标核酸进行绝对定量。在这些方法中,数字聚合酶链反应(PCR)通常用于DNA扩增和绝对定量,其也是众多数字化分析检测方法的起源。dPCR由于其反应时间长且需要精细的温度控制,因此对于POC应用并不理想。等温扩增(如LAMP)提供了一种快速,低成本的选择,利用同样的数字化思路,dLAMP的出现和发展逐渐得到人们的关注。本推送主要介绍dLAMP的主要技术原理。

1.什么是LAMP及其技术原理

之前的推送一直没有好好解读LAMP的技术原理。环介导等温扩增(LAMP)是用于DNA扩增的单管技术,与PCR相比,等温扩增是在恒定温度下进行的,不需要热循环仪,因此可大大减少仪器的复杂度,更便于开发POCT仪器。该技术最早报道于2000年日本学者Notomi发表在Nucleic Acids Research的文章。一经发布,就受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注,短短几年,该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中。截止到目前为止,文章被引超过5500次。

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从原理上讲,LAMP使用两套或三套引物和一种具有复制活性以及高链置换活性的聚合酶,可在60–65°C的恒定温度下扩增靶序列通常,使用4种不同的引物来鉴定靶基因上的6个不同区域,从而大大提高了特异性。另外一对“环引物”可以进一步加速反应。由于这些引物作用的特殊性质,在LAMP中产生的DNA量明显高于基于PCR的扩增。另一方面,引物的增加也使得LAMP引物设计变得更加困难,常常需要依赖第三方软件和报道文献进行辅助设计。

LAMP的扩增产物可以通过光度法进行检测LAMP反应溶液中作为扩增副产物的焦磷酸镁沉淀可以通过肉眼轻松观察,特别是对于较大的反应量,因此可用此开发肉眼读出的POC传感器。同时,LAMP也可通过测量浊度或通过使用嵌入染料(例如SYTO 9)进行荧光实时跟踪反应SYBR green等染料可以用于创建可见的颜色变化,而无需使用昂贵的设备即可用肉眼看到该颜色变化,或者可以通过仪器更准确地测量出响应。

LAMP的反应体系一般包括4条引物、Bst DNA聚合酶缓冲液、具有链置换特性的Bst DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、甜菜碱、Mg2SO4等。LAMP检测体系中基因的扩增和产物的检测可一步完成,扩增效率高,可在30~60 min扩增109~1010倍,特异性较高;同时反应过程中,从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产生副产物焦磷酸镁。LAMP技术的主要原理是DNA在65 ℃左右可以处于动态平衡状态,DNA在此温度下利用4条特异性引物依靠一种链置换DNA聚合酶,使链置换DNA的合成不停地自我循环。

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2.什么是Digital LAMP

Digital PCR类似,最早报道Digital LAMP也是利用物理腔室进行反应分隔,只不过Digital LAMP直接使用了当时成熟的微流控芯片文章的作者有加利福尼亚大学伯克利分校的Luke P. Lee教授和Daniel T. Chiu教授,其都是该领域的绝对大咖

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数字化的本质是对LAMP反应体系的分割化,使得每个微小的反应腔室的核酸模板数少于或者等于1个。经过扩增之后,有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号,没有模板的反应器就没有荧光信号,通过计算荧光信号的比例和泊松公式计算出核酸分子的绝对数量。

文章另一个特点是使用一种叫做自数字化的微流控技术(self-digitization chip),这种技术常见于细胞捕获(如循环肿瘤细胞的捕获和分析)和化学合成中。根据文章报道,Digital LAMP能够在70分钟内完成整个检测,最低可检测20个拷贝的噬菌体DNA。

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        之后的研究报道更多采用液滴微流控技术进行Digital LAMP,检测灵敏度也达到了几个拷贝。于此同时,Digital LAMP在细菌、病毒检测上也逐步展开,甚至逐步拓展到其它体外诊断领域。其中最为出名的是Rustem F. Ismagilov教授发到Science Translational medicine上的一篇文章,其使用Digital LAMP在30分钟内完成了常规方法需要几天的抗体敏感性实验AST

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3.数字化核酸扩增的特点和平台

准确度高

通过样本的离散化,极微量的变异分子与正常分子被区分开来,使得稀有突变基因被单独检测,再通过阳性信号单元所占的数量和比例来精准地计算突变率或突变量。

灵敏度高

有对低拷贝核酸分子数的区分能力,这是LAMP难以达到的。

绝对定量

以阳性信号和阴性信号微单元的数量及比例来确定原始样本中目标核酸分子数,不需建立标准曲线即可进行精确定量。

不易受抑制剂的影响

通过分散到各个反应微单元,能够有效降低了抑制剂对扩增的影响。

如今,商业化的dPCR平台不断面世,主要有Fluidigm公司的Bio-MarkTM高通量基因分析系统、Bio-rad公司的QX100和QX200微滴式dPCR系统、ThermoFisher公司的QuantStudioTM3DdPCR系统、RainDanceTechnologies公司的RainDropTMdPCR系统和Formulataix公司的ConstellationTMdPCR系统等。为了对比Digital LAMP与其它方法在检测性能上的区别,研究者通过使用Bio-rad公司的微滴式dPCR系统和Fluidigm的Biomark 12.765 Digital Array平台检测人巨细胞病毒,结果显示dLAMP具有更好的抑制剂抵抗力。

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4.总结

数字化核酸扩增技术是一种高灵敏度、高准确度、高辨识力、高耐受性、可实现绝对定量分析的核酸分子诊断技术,是现有核酸诊断技术的补充,其所具备的应用优势必将大大推动生物学研究、临床诊断、食品安全和环境监测等领域的发展。同时,它也预示着一个拥有巨大潜能的新兴产业和技术。dLAMP相对于dPCR速度更快,成本也更低,在dPCR难以实现POCT的情况下,不失为一个新的选择。目前的数字化核酸扩增技术仍处于待完善阶段,还存在许多不足之处。比较经典的Bio-rad液滴式dPCR系统由液滴发生器、PCR扩增仪和液滴信号读取器3种设备配套组成,集成度差,仪器成本高,一般的实验室难以承受。数字化核酸扩增技术的通量增高或者微单元体积缩小时,现有信号采集的方法难以做到简便、快捷、准确,常需要后期繁琐的信号处理与分析过程。但是,随机技术的不断进步,相信这些技术会逐步出现在体外诊断的各种产品中。

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