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DNA提取技术原理、注意事项及不同样品提取试剂盒推荐

作为一切分子生物学研究的基础,核酸的提取永远是开展一项研究的第一步,提取核酸的质量高低是下游分子生物学实验成败的关键。本文将会详细介绍关于DNA提取的相关信息,包括DNA提取的原理、提取过程的注意事项、不同类型样品DNA的提取推荐方法等等。

DNA提取的基本原理

DNA的提取可以简单的分为裂解和纯化两大步骤,裂解是破坏样品细胞结构,从而使样品中的DNA游离在裂解体系中的过程,纯化则是使DNA与裂解体系中的其它成分,如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。

裂解过程

常规的裂解液都含有去污剂 (如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20等) 和盐 (如Tris、EDTA、NaCl等)。

· 去污剂的作用

· 使蛋白质变性;

· 破坏膜结构;

· 去除与核酸相互作用的蛋白质。

· 盐的作用

· 提供合适的裂解环境,如Tris;

· 抑制核酸酶对核酸的降解,如EDTA;

· 维持核酸结构稳定,如NaCl。

裂解体系中还可能加入蛋白酶,利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段,促进DNA与蛋白质的分离,同时,也便于后续的纯化操作

纯化过程

酚氯仿抽提

该方法包括两个步骤:

00001. 利用酚氯仿对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质,实现DNA与蛋白质的分离;

00002. 再用醇将DNA沉淀下来,实现核酸与盐的分离。

酚氯仿抽提是去除蛋白质的有效手段,但如果蛋白质含量超过了其饱和度,裂解体系中的蛋白质就不会被一次性去除,需要进行多次反复抽提,而每次的抽提均会导致核酸的损失

酚氯仿抽提最大的优势是成本低廉,对实验条件要求较低

高盐沉淀法

高盐沉淀法是酚氯仿抽提方法的一个变种,其省略了酚氯仿抽提操作的麻烦,并且几乎克服了酚氯仿抽提方法的一切缺点,只是得到DNA的纯度不够稳定

离心柱纯化

该方法利用某些固相介质,在某些特定的条件下,选择性地吸附核酸而不吸附蛋白质及盐的特点,实现核酸与蛋白质及盐的分离,是目前试剂盒提取广泛使用的方法

该方法受人为操作因素影响小,提取DNA的纯度稳定性很高,其缺点是当样品过量时,需要反复进行离心,对样品的提取效率较低。

磁珠法

磁珠磁场移动平台

该方法将纯化介质包被在纳米级的磁珠表面,通过介质对DNA的吸附,在外加磁场的作用下使DNA附着于磁珠并定向移动,从而达到核酸与其它物质分离的目的。

与其它集中方法相比,磁珠法具有无可比拟的优势,包括:

· 提取灵敏度高 (只需微量的样本);

· 纯化的纯度高 (能够使核酸完全与杂质分离);

· 提取产量高 (每mg磁珠能吸附500μg DNA);

· 分离速度快 (磁场分离只需几秒钟);

· 自动化操作 (通过机器自动完成操作过程,无需人力);

· 高通量提取 (可同时完成数百个样品的提取);

· 无毒无害无污染 (试剂中不含任何有毒物质)。

该方法依赖于磁力分离装置或自动提取仪,目前价格依然很高,并不适用于小型实验室常规实验

DNA提取的注意事项

样品的采集和保存

样品的采集和保存是DNA提取的第一步,合适的样品采集和保存方法对于DNA提取的成败至关重要,尤其是有些珍贵样品,其采集和保存的方式更是需要特别关注。

动植物样品的采集

· 动物的内脏和皮肤样品要在动物死亡后2h以内采集,通常采集多个重复,切成小块保存在消毒后的离心管中;

· 动物呼吸道样品通过棉拭子进行蘸取,完成采样后立即置于5mL磷酸盐缓冲液中

· 动物血液样品采集后,立即加入抗凝剂,封口病竖立插入样品盒,尽量不要使用肝素抗凝

· 植物样品采集时优先选取核酸含量较多的部位,如植物的幼嫩部位

· 采集植物样品时建议使用无菌水或75%乙醇擦拭或冲洗干净,再用吸水纸吸干样品表面液体。

微生物相关样品采集

针对微生物研究相关的样品,首先要避免人源污染,采样的器具都应经过高温灭菌,采样过程中要戴手套。

其次要关注样品运输和处理的速度,很多环境微生物研究的样品并非来自实验室,而是来源于自然环境,有些样品的采集位点甚至在人迹罕至的地区,这就涉及到样品的运输问题。最理想的样品运输条件是在液氮中冷冻运输,如没有条件也可将样品装入含有冰袋的泡沫箱中运输,如样品运输距离较远、时间较长,最好选择专业的冷链运输公司

针对水体样品微生物群落的研究,需要用抽滤的方式将样品中的微生物浓缩至滤膜上,之后再提取其DNA,通常情况下普遍认为采用0.22μm孔径的滤膜进行抽滤能够收集到水体样品中的完整微生物群落。

有时我们会首先使用0.8μm孔径的滤膜对水体样品进行预处理,以去除大的颗粒物质,之后再用0.22μm滤膜收集微生物,这时会遇到一个问题,就是去除的颗粒物质也会吸附一部分微生物,因此造成了最终收集的微生物样品不完整,本人之前的一篇文章就被审稿问了这个问题,所以在进行样品处理的时候,一定要首先明确要研究的是被颗粒物吸附的微生物、还是游离态的微生物、或者是完整的微生物群落,以确定最适合的抽滤方案

样品的保存

绝大部分情况下,使用新鲜样品可以获得最好的结果。如果组织样品不能马上进行DNA提取,短期内可以冷冻于-20℃,稍长时间的保存可以采用无水乙醇进行固定

此外还推荐另外一个可以长期保存的方法 (适用于有钱人),可以使用QIAGEN公司的RNAlater进行组织样品的保存,这个试剂不仅可以保存RNA,同时也能够防止DNA的降解,本人之前有过保存了一年左右的样品,DNA提取的效果同样很好。

DNA提取方法的选择

开展针对某个实验样品的DNA提取之前,一定要先行收集该样品的特性信息,例如该样品的核酸含量、酶含量、特殊杂质含量等,否则就会造成DNA提取失败,从而无法开展后续实验。只有对实验样品有所了解,才能正确选择DNA提取方法

含蛋白酶的裂解方法,可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。蛋白酶的作用是分解蛋白质,从而使蛋白质变小,促进蛋白质的游离,基因组DNA是很容易“缠”住其它生物大分子物质,蛋白质被蛋白酶消化变小后,不容易被基因组DNA“缠”住,有利于蛋白质在纯化过程中被去除,使最终获得的基因组DNA的纯度更高。

CTAB的裂解液,是针对富含多糖样品 (如细菌、植物等) 基因组DNA抽提的首选裂解方法CTAB的质量对裂解效率有很大的影响,尽量使用高纯度的CTAB,并且不要轻易更换生产厂家。CTAB的少量残留也会对酶活性有巨大影响,所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度,一般使用65℃,但如果发现DNA降解严重或者得率太低,可以尝试在37~45℃进行裂解

当对大量纯培养细菌进行PCR鉴定时,可以直接使用未裂解的菌体当作模版进行PCR,只需延长PCR预变性的时间,即可在该阶段完成菌体的裂解并释放DNA。但是该方法由于没有经过纯化的过程,因此可能出现一定的假阳性,该方法最适合从大量菌株样本中筛选含有特定基因的目的菌株,但是并不适合判断某一特定菌株是否含有目的核酸片段。

DNA的保存

提取得到的DNA通常使用TE buffer进行最后的溶解,其含有的EDTA可以减少DNA被可能残留的DNase降解的风险,但是如果提取方法合适、操作得当,则几乎不会残留DNase,使用无菌水溶解DNA也是可以的

提取到的DNA一般情况下在-20℃保存是没有问题的,但是要避免反复冻融,因此,最好在提取完成之后按照后续实验所需进行分装,这样每次使用一个分装好的DNA,避免反复冻融造成的DNA降解。如果提取的DNA需要长期保存 (一年以上),最好保存于-80℃。

DNA提取试剂盒推荐

动植物及纯培养微生物样品DNA提取试剂盒推荐

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微生物群落样品DNA提取试剂盒推荐

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