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微流控芯片作为微型化液体环境的细胞培养装置

微流控芯片作为微型化液体环境的细胞培养装置,具有稳定的技术及其功能,近年来在 生物工程、生物医药、医疗检测领域有着很好的延伸前景,每种领域里都有相应的微流控芯片类型,衍生出了较多种类的微流控芯片。同时,每种不同材料的微流控芯片都具有其相应的材料特性,也有不同的检验检测方法。iGEM 是来自麻省理工大学的世界性合成生物学竞赛,比赛倡导通过合理的合成生物学改造来解决实际遇到的问题。2017 年是 iGEM_BIT 队与 XMU-CHINA 合作的第一年,本文主要介绍了两队的微流控芯片制作、检测方法以及实验成果展示。

10~100μm 宽的沟道系统中对流体或气体进行操控的技术被称为微流控技术,以微流控技术为核心、通过 MEMS技术加工出的应用于生物、化学、生物医学等领域的芯片型微全分析系统被称为微流控芯片。20 世纪 90 年代中后期,随着微制作技术的发展,微流控芯片研究经历了一个迅速发展的时期,制作技术也日臻完善,各种基于微流控芯片的单元操作技术也层出不穷。进入到 21 世纪初后期,大规模集成成为微流控芯片的发展潮流。目前微流控芯片已经成为发展最为迅猛的分析研究技术。

目前常见微流控芯片主要有三个种类:单晶硅片、石英和玻璃、高分子聚合物。

玻璃、PMMA、PDMS微流控芯片

最早的微流控芯片是用单晶硅制作。这主要得益于成熟的微电子和微机械加工技术。玻 璃微流控芯片具备优良的光学性能和支持电渗流特性,易于表面改性,可直接借鉴传统的毛 细管电泳分析技术,因此在微流控芯片发展初期受到更多重视并得到相应发展,至今仍是最 广泛使用的芯片之一。用玻璃材料制作微流控芯片具有很多的优越性,但聚合物以其较玻璃 价廉,制作方法简单,生产成本低,可制作一次性使用芯片等特点,正日益为人们所关注。

为了实现 2017iGEM_BIT 队伍生物部分的工业大规模化生产,iGEM_BIT 队伍自主设计研 发了微流控芯片。 微流控芯片为整套生物学检测方法提供了两个反应腔室,两个腔室分别是用于磁珠适配体的检测和工程菌的荧光表达。通过真空冻干法将适配体和工程菌菌液预先分步冻干于芯片内,将使得芯片的快速检测程度得到很大的提升。此外,设计的仪器采用了 同时能检测红光和绿光的共聚焦式光学通路(光学器件来自于公司名),有效的降低了光学 仪器占用的空间,又不影响光学检测精度。仪器中配套微流控芯片负压法注样而使用的蠕动,最低泵速为 6ul/min,在 39ul/min 时达到最好精度 (±2%)。

在项目研发过程中,我们设置并进行了以下的实验:

1、 微流控芯片及芯片外工程菌的生长曲线测定

2、 微流控芯片及芯片外含阿拉伯糖诱导型启动子的工程菌在阿拉伯糖诱导下报告基因的 表达情况(芯片外测试涉及到无氧情况的影响)

3、 微流控芯片内磁珠适配体冻干实验(包括芯片外冻干及与甲胎蛋白反应情况)

4、 微流控芯片的光学检测(定性)

5、 微流控芯片的热学检测(定量)

6、 光学仪器的模拟

实验展示:

一、 微流控芯片及芯片外工程菌的生长曲线测定

实验目的:表征细菌在芯片上的生长情况,评估芯片的细菌培养能力

设计思路:通过 OD 值与荧光强度来表征细菌的生长状况并通过与芯片外(培养试管内)细 菌生长情况对比反映芯片的细菌培养能力。用于测定这两个参数的酶标仪不支持对芯片的直 接检测,因此需设法将芯片内菌液排出。考虑到芯片内菌液的体积定量问题与余液问题,我 们采用了排出液体——定量取液——稀释的方法从芯片内取出菌液置于 96 孔板上进行检测。

实验设计:变量设计:时间(每 2 小时测定一次)

对照设计:细菌生长场所:芯片内与培养试管内

结果指标:由测量结果绘制的 OD-时间曲线与荧光强度-时间曲线

实验材料:7ml LB 无抗培养基、无菌水、氯酶抗生素(与菌种抗性有关)、负二十摄氏度 甘油保藏的菌种、注射器、微流控芯片(使用直径 12mm 圆形培养腔,腔室高度 0.4mm, 准备数量由预计测量时间与测量间隔决定)、96 孔板、1.5ml 离心管(每次检测 2 个)

实验步骤:

①:芯片预处理

使用注射器以 100μl/min 的流速分别注入 5ml 无水乙醇和 3ml PBS 缓冲液,隔夜晾干。

注意:

①:芯片的预处理对于芯片培养细菌的能力有很大影响

②:乙醇可冲洗掉未完全固化的光胶

③:PBS 的作用在于冲洗掉残留乙醇并对芯片腔室表面进行处理,利于细菌生存

②:隔夜复苏菌种 J-D-P(plux-RBS-LuxR-RBS-Luxl-RBS-LacI-RBS-GFP-T)(可表达 GFP) 7ml 无抗培养基加入 3‰的氯酶(21μl)和 100μl 负二十摄氏度甘油保藏的菌种,在 37℃ 摇床隔夜培养。

③:转接菌种

7ml 无抗培养基加入 3‰的氯酶(21μl)和 100μl 隔夜培养的菌液,在 37℃摇床培养 1h。

④:开始检测,注入菌液

在培养试管中均匀取 100μl 菌液点样在 96 孔板上,点三次样,检测 OD 值和荧光强度。 在培养试管中均匀取 100μl 菌液加入洁净 1.5ml 离心管中,用注射器吸取菌液注入芯片, 将芯片置于枪头盒内,放入 37℃摇床培养。

注意:由于实验过程中未使用泵进行注射,因此此注射方式为手动注射,要求用力尽量均匀 并稍微倾斜芯片防止注射过程中产生气泡

⑤:排出菌液检测

两个小时后,取出芯片,用注射器注入空气,排出菌液至 1.5ml 洁净离心管。从离心管与 培养试管中分别吸取 70μl 的菌液至另外一洁净 1.5ml 离心管,另吸取 280μl 无菌水稀 释菌液。再从稀释的菌液中取 100μl 点样于 96 孔板上,各点三次样,检测 OD 值和荧光 强度。

注意:可倾斜芯片使液体顺利排出

⑥:重复⑤每两个小时测一次。

⑦:画出 OD-时间曲线和荧光强度-时间曲线。

实验结果:

12 小时培养得到的大肠杆菌的 OD-时间曲线和荧光强度-时间曲线

1 12 小时培养得到的大肠杆菌的 OD-时间曲线和荧光强度-时间曲线

结果分析:

由曲线可以看出,芯片内 OD 曲线在 8h 后有比较明显的下滑,芯片内的荧光强度在 4-12h 也呈下降趋势,且芯片内的 OD 值整体低于离心管内 OD 值。我们分析可能的原因在于:①: 芯片内环境相对试管中较为狭窄,对细菌的代谢活动有一定影响。②:芯片透气性不足,菌 群数量达到一定程度时面临缺氧问题。

二、微流控芯片及芯片外含阿拉伯糖诱导型启动子的工程菌在阿拉伯 糖诱导下报告基因的表达情况(芯片外测试涉及到无氧情况的影响)

模块一:探究芯片内缺氧环境对细菌生长表达的影响

实验设计:由于之前在芯片中的细菌的培养实验结果与离心管内培养的结果相差较大,经过 分析我们认为可能芯片内的缺氧环境对细菌的生长和表达产生了影响。所以我们设计了芯片 外的模拟缺氧环境来探究这种影响。并且使用了受阿拉伯糖诱导表达的大肠杆菌作为菌株, 设置不同浓度的阿拉伯糖浓度(10g/L、5g/L、1g/L、0.1g/L、0.01g/L、0g/L)。

实验材料:受阿拉伯糖诱导表达的大肠杆菌(pbad-RBS-LacI-RBS-GFP-T-plac-RBS-RFP-T)、 氨苄抗生素(AMP)、100mg/ml 的阿拉伯糖溶液、7ml 无抗 LB 液体培养基、无菌水、PCR 管、 1.5ml 离心管、96 孔板。

实验步骤:

①加入材料,复苏细菌

7ml 无抗 LB 培养基中分别加入 100μl 甘油保存的菌种、1‰的 AMP(7μl), 再分别加入 0.7μl、7μl、70μl、350μl、700μl 的 100mg/ml 的阿拉伯糖溶 液。置于 37℃摇床培养复苏 1h。

②分装入 PCR 管和离心管

取出复苏的菌,分别加入 100μl 吹匀菌液至 1.5ml 离心管(每一个梯度阿拉伯 糖各四管),250μl 吹匀菌液至 PCR 管(基本加满,每一个梯度阿拉伯糖各四管)。 在放置板上放置好,置于 37℃摇床培养。另取 100μl 菌液在 96 孔板点样,每 一个梯度点三次,检测 OD 和荧光。

③稀释检测

每两个小时取出每个浓度的 PCR 管和离心管,各取出 70μl 置于另一洁净 1.5ml 离心管,稀释 5 倍,取 100μl 菌液在 96 孔板点样,各点三次,检测 OD 和荧光。

④拷出数据,画出生长表达曲线。

实验结果:

本次的阿拉伯糖的诱导试验:离心管和 PCR 管内大肠杆菌的生长曲线和荧光曲线 图 3 以前的阿拉伯糖的诱导实验:96 孔板内大肠杆菌的荧光曲线

2 本次的阿拉伯糖的诱导试验:离心管和 PCR 管内大肠杆菌的生长曲线和荧光曲线 图 3 以前的阿拉伯糖的诱导实验:96 孔板内大肠杆菌的荧光曲线

实验结果表明缺氧环境下细菌的生长和表达都用一定的下降,这的确是在芯片内培养菌 和在外界培养的一个较大不同,关于阿拉伯糖浓度对大肠杆菌诱导,对比之前所作实验(探 究阿拉伯糖对工程菌的荧光表达的影响)可以发现阿拉伯糖的诱导并非浓度越高越有效。

一、 微流控芯片内磁珠适配体冻干实验(包括芯片外冻干及与甲胎蛋 白反应情况)

微流控芯片的光学检测(定性)

实验目的:查看芯片的光学分布

实验设备:3 个芯片中的 6 个腔室、一支 1mL 注射器、4 个离心管。

实验材料:荧光微球蛋白溶液、荧光素钠溶液

实验步骤:实验分为两个部分:一、定性部分 二、定量部分

定性部分

1、先将荧光相比荧光素钠较强的荧光微球蛋白 50uL 溶液注入芯片。

2、芯片在注射过程中保持倾斜 30°角,实验人在注入过程中尽量保持注射过程 缓慢而匀速。

3、为了做比对,选择将浓度不变的荧光微球直接滴加到载玻片上,观察荧光分 布。

4、在原载玻片上盖上盖玻片,再观察荧光分布。

定量分布

1、称取 0.3763g 的荧光素钠加入到 10mL 的蒸馏水中,配成 0.1mol/L 的荧光素 钠溶液。

2、 0.1mol/L 的荧光素钠溶液分别稀释 7000 倍、10000 倍、20000 倍分别得到 荧光素钠溶液①、②、③。

3、各抽取荧光素钠溶液①、②、③100uL 加入到 96 孔板中进行荧光值的测量(增 益选 50)。 3、将荧光素钠溶液①、②、③分别加入到芯片中,观察荧光分布。

实验结果:

荧光素钠溶液的荧光值

3 荧光素钠溶液的荧光值

实验结论:

一、首先比较了图一、图二我们发现我们的芯片透光性很好,在芯片内和在载玻片上的荧光 是差不多的。

二、通过图 3,即盖上了盖玻片以后,我们发现荧光强度大大减小,本来为了做对比,应该 找一个能装 50uL 的槽盖上载玻片进行观察。可是由于条件较为严苛,未能实验,但是我们 结合第一个结论,依然可以得出光胶并未太多的影响光的分布

三、通过图 4、图 5、图 6,我们可以发现芯片的透光性还是可以的。结合图 7 我们的荧光 测量,则定量的说明了我们芯片的透光性良好

四、微流控芯片的热学检测(定性/量)

光学仪器的模拟

实验目的:验证我们设计的检测光路,根据验证结果优化光路

设计思路:使用实际元件进行光路验证存在诸多不便:首先光学元件价格较高,盲目进行实 验可能造成不必要损失,其次,根据验证结果不断调整元件位置的过程较为费时费力。为了 避免时间与金钱的浪费,我们采用光学仿真的方法来为我们后续的光路搭建提供指导与参考。

实验设计:利用 Zemax 软件,根据 thorlabs 网站上提供的元件参数进行模拟光路搭建过程, 并通过在软件中查看检测面的光圈分布评判我们光路的效果,并以此为根据对我们的光路进 行改良。

使用元件:平凸透镜(2 个)型号:LA1304,焦距:4mm,曲率半径:20.6mm 二向色镜(实际仿真过程中表现为反射面)

实验过程:

图 13 光学仿真使用的 ZEMAX 界面

13 光学仿真使用的 ZEMAX 界面

 光学仿真中的光路图

14 光学仿真中的光路图

仿真过程主要出现了两个问题:

1、光圈过小

解决方法:光圈过小,最先想到的是两个方面:一、透镜折射率过大,二、检测面与二色镜 靠的太近,所以最直接的是将检测面的 Y 值(即纵坐标值)由 30 变为 40. 此时出现了第二个问题

2、光圈太暗

解决方法:从上图中我们发现光的发散角过大,导致很多光都照到了管壁,所以减小发散角 或增加光阑即可,于是得到最终结果。

图 15 光学仿真中遇到的问题

15 光学仿真中遇到的问题

图 16 侦测器结果

16 侦测器结果

从图 2 我们可以得知光路仿真结果较好,光的分布较为均匀,光的强度较弱,是因为光源选 的功率只有 1W,简单地增加光源强度即可,此处不再赘述。

结论:

我们选用的 LA1304 透镜符合我们的基本要求,达到我们较为理想的结果,仿真成功。