用于血脑屏障研究的器官芯片-汶颢股份
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用于血脑屏障研究的器官芯片

通过结合微流体,微制造和细胞培养技术的原理,出现了新一代的实验室平台,称为“片上器官”。器官芯片系统是包含活细胞的微流体装置。与先前的体外模型相比,这些微流体装置可以更好地概括微环境。微流体装置特别适用于模拟生物屏障,例如血脑屏障,因为它们可以模拟血流。  

血脑屏障的结构和功能

血脑屏障(BBB)是细胞的边界层,其排列脑微血管并将血液与脑间质液分开。血脑屏障的主要功能是通过允许选择性运输营养物质,但防止血液中的有毒物质进入大脑,充当物理和代谢屏障。

BBB由专门的内皮细胞组成,其被基底膜和四种其他类型的细胞包围:星形胶质细胞,周细胞,神经元和小胶质细胞。这五种类型的细胞和基底膜一起构成了神经血管单元(图1)。在BBB的相邻内皮细胞之间形成称为紧密连接的密封蛋白复合物。结果,细胞彼此紧密靠近,从而阻塞细胞内空间并阻止细胞旁转运。这种高屏障紧密度是BBB的特征,对维持脑内稳态至关重要。屏障紧密度的局部破坏导致通过屏障的渗漏与中枢神经系统(CNS)的几种疾病相关[2]。了解和克服BBB对于治疗CNS疾病至关重要。能够暂时打开屏障,允许药物通过并到达大脑的药物输送系统是治疗CNS疾病的关键研究领域。

图1.神经血管单元的图示 

1.神经血管单元的图示

血脑屏障的体外模型

在人工环境中,条件可以保持在高度控制之下,并且可以独立地研究特定行为而几乎不受其他因素的干扰。传统上,BBB已经在体外重建为使用常规细胞培养设置的静态模型。微流体器官芯片装置提供了解决先前体外许多缺点的解决方案楷模。这些装置可以设计成更真实的结构,并且它们的小尺寸更好地代表神经血管单元中毛细血管的几何形状。此外,通过采用微流体而不是在本体溶液中进行实验,模型可以显示生理现象,例如流体流动和剪切应力。BBB-on-chip模型的另一个优点是可以集成用于实时监控的传感器。

微流控芯片上的血脑屏障

下面介绍两种早期的微流体装置,这些装置率先开发了片上BBB,并为几个有前景的概念提供了原理验证。还将介绍在开发用于研究BBB的器官芯片装置时要考虑的一些重要设计方面和验证参数。如今,用于片上器官应用的即用型芯片已在市场上出售或可订购定制。

据我们所知,Booth等人。是2012年首次发布BBB芯片模型并在2014年发表了一篇后续论文。如图2所示,它们的装置包括PDMS层中的两个交叉通道,深度为200μm,宽度分别为2mm和5mm。两个通道由覆盖有纤连蛋白的多孔聚碳酸酯膜隔开。通过具有薄膜Ag / AgCl电极的玻璃载片覆盖通道层,其中四点感测结构放置在膜上。将小鼠内皮细胞(b.End3)和鼠星形胶质细胞(C8D1A)在膜的相对侧共培养。在两个通道中施加2.6mL / min的流速,根据本文中提供的计算,其对应于内皮细胞上2mPa的剪切应力。2带有集成的薄膜电极。此外,用免疫荧光鉴定紧密连接蛋白ZO-1,并进行渗透性研究以确认屏障功能。

图2. Booth等人开发的BBB-on-chip示意图和图片。(转载自Booth等人) 

2. Booth等人开发的BBB-on-chip示意图和图片。(转载自Booth等人

另一种完全整合的BBB装置由Griep等人出版。在2013年。该装置由两层PDMS组成,所述PDMS包括宽度为500μm且深度为100μm的通道,其间具有涂覆有胶原的聚碳酸酯膜。将人脑微血管内皮细胞(hCMEC / D3)培养在膜的顶部。他们使用四根铂丝来监测阻抗光谱测量7天内的TEER值。他们获得的平均TEER值为28Vcm 2 ±1.3 SEM)。当施加2.5mL / h的流速时,他们观察到TEER的增加,高达120Vcm 2,对应于0.58Pa的计算剪切应力。

图3.芯片层(a)和组装芯片(b)的示意图,以及Griep等人开发的片上BBB的图片。(转载自Griep等人) 

3.芯片层(a)和组装芯片(b)的示意图,以及Griep等人开发的片上BBB的图片。(转载自Griep等人)

用于片上器官的芯片材料

PDMS已被广泛用于制造器上芯片器件。PDMS的一些优点包括生物相容和透明(240 nm - 1100 nm),便宜且易于处理,可以高分辨率成型,并可粘合到玻璃或PDMS。然而,它是高度疏水的,当填充通道或为非泄漏芯片获得紧密结合时可能是有问题的。此外,难以在PDMS的表面上沉积电极,因此玻璃通常用于具有图案化薄膜电极的器件中。

NPG72是一种新型热塑性材料,具有极好的片上器官应用前景。它具有与PDMS相同的优点,但不像PDMS需要几个小时才能成型,NPG72芯片可以在几分钟内完成。

芯片模型中的血脑屏障细胞

所使用的细胞类型对于构建生物相关性模型非常重要。然而,目前尚不清楚神经血管单元的不同细胞究竟是如何促成屏障功能的[8]。为了模仿人类BBB,使用人类细胞显然是最具预测性的。人脑毛细血管内皮细胞已被广泛表征,但可用性和再现性低。人类诱导多能干细胞(hiPSC)的最新进展有望克服这些困难。

预期将内皮细胞与来自神经血管单元的其他细胞共培养是更生理学相关的表现,因为这些细胞也影响屏障的形成和维持。已经发表了几项关于微流体BBB模型中共培养的研究,主要是带有星形胶质细胞的内皮细胞还有神经元和周细胞。星形胶质细胞和内皮细胞彼此不直接接触,但被基底层分开。在微流体装置中,它们可以在膜的不同侧面上培养。然而,装置中的膜太厚,细胞 - 细胞接触将受到限制。为了模拟细胞外基质的3D环境,水凝胶已被用作微流体室内的细胞接种支架。

剪切内皮细胞的压力

由于血压和剪切应力,神经血管单元中BBB的内皮细胞受到垂直于血管壁的力。由血流引起,在流动方向上。已经报道剪切应力影响内皮细胞形态和功能,并对屏障形成具有积极作用。与其他类型的器件不同,片上器件器件具有适合于结合流体流动的巨大优点。活体血管具有圆形横截面,而微流体装置通常具有矩形横截面。在具有圆形横截面的管中,由于圆柱对称,剪切应力在壁上将是相等且均匀的。然而,在矩形横截面的情况下,剪切应力将不均匀。为了在矩形截面中获得最均匀的应力,通过将通道设计成通道高度远小于通道宽度,可以实现尽可能平坦的流动剖面。毛细血管的生理剪切应力为0.3-2 Pa。

经内皮电阻(TEER)

TEER描述了跨细胞屏障的抗性,并且通常用作验证参数来控制BBB模型中的内皮细胞是否形成紧密连接复合物。如果内皮细胞正常生长并与相邻细胞形成紧密连接,则细胞层的细胞间隙被阻塞,电流流动受到限制这导致更高的电流阻抗,这反映在更高的TEER值中。TEER通常表示归一化到在单位Ωcm的膜面积2,如在下面,为了便于直接比较其他模型。

图片4.png 

BBB片上模型中,测量TEER是一种快速,非侵入性的方法,可以实现对屏障质量的实时评估。通过在蜂窝层上施加低电流来执行测量,同时测量电池层阻止多少电流。片上器件装置适用于集成传感器,其中TEER可以实时监控,这在其他类型的装置中是困难的。在体外 BBB的模型需要达到高于150-200Ωcm的TEER值2被认为是可接受的模型[19]。这比报道的体内结果低约10倍。接受低得多的TEER的原因是由于体外条件的简化。

芯片模型上血脑屏障的渗透性

通过测试屏障对不同物质的渗透性,片上器官模型可以直接提供关于屏障功能的信息。以易于与体内比较的方式量化渗透性是有用的数据。穿过屏障的被动传输可以从流过芯片的分析物的渗透系数来量化。值得注意的是,扩散以外的因素可能有助于运输,如细胞屏障中存在间隙时的对流,以及由于通道之间溶质浓度的差异引起的渗透流。这可以通过控制通道中的溶质一致性并在实验期间在两个通道中具有相同的压力来避免。由于亲水性化合物穿过屏障的运输非常受限制,因此这些用荧光示踪剂标记的化合物通常用于渗透性研究。然后可以用荧光显微镜观察渗透性。

MAMI项目博士生EmmaThomée撰写,资助来自欧盟的Horizon 2020研究和创新计划,资助协议编号为766007。 

emma.thomee [在] elvesys.com