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生物芯片在食品检测中的应用进展(上)

0  引言

目前,食品安全问题在全球越来越受到重视。无论是对频发中毒现象的食品以及召回事件的食物品质的改善,还是人们对营养健康日益增加的需求,都需要科学技术的不断创新和大力支持。这就促使各种食品高新检测技术的不断进步,从20世纪80年代的聚合酶链式反应(PCR)到后来的荧光定量PCR反应,各种新的分子生物技术开始逐步应用到食品检测中。

食品检测 

20世纪90年代,生物芯片作为一种全新的生物技术逐渐成熟并发展壮大起来。该技术具有高通量、微量化和自动化等特点。伴随着芯片技术的迅猛发展,生物芯片在医疗领域]、农业领域以及国防领域都有所突破,作者简要介绍生物芯片的基本原理,并对生物芯片在食品安全、营养与品质检测方面的应用作了较为详细的介绍。

1  生物芯片概述

生物芯片技术是一项综合的高新技术,涵盖了生物学、化学、医学、物理学、材料学、电子技术、生物信息学、机密仪器等交叉研究领域。生物芯片(biochip)是指将标记的生物探针固定排列于支持物(硅片、载玻片或高分子聚合物薄片)上,待检测样品与支持物上的探针发生特异性亲和反应后,通过扫描并借助计算机软件分析每一探针上的标记信号,从而完成对DNA、RNA、多肽、蛋白质等生物物质的检测。它包含三大领域:基因芯片、蛋白质芯片和芯片微缩实验室。基因芯片是利用样品和探针之间基因的碱基配对原理进行杂交。蛋白质芯片利用抗体和抗原之间特异性免疫的原理。芯片微缩实验室则是集各种生物芯片于一体的生物分析系统,使用方便快捷且高效便携,是未来生物芯片的发展方向。相比蛋白质芯片和芯片微缩实验室,基因芯片的应用范围和普及程度更为广泛。生物芯片是微量生化分析的基础,相比传统的分析方法,它的优势显著:各种分析物可以在同一样品上同时进行研究;所需样本量少;对于稀缺试剂的消耗量低;高度微量化;高通量。它可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、食品检测、环境检测、国防等领域。总之,凡与生命活动有关的领域中,生物芯片均有其重大的应用前景。

生物芯片的应用场景 

制备生物芯片所需的载体材料必须是固体片状或者膜,由于玻璃方便易得且荧光背景低,故玻璃片是最为常用的载体材料,通常会将活性基因连接在载体玻片上。以基因芯片为例,其制作技术主要有3步:芯片制备、样品制备与杂交、芯片的检测与分析。其中芯片制备包括原位合成和预合成后点样。

2  生物芯片在食品安全检测中的应用

中国食品行业安全问题日益突显,传统的检测方式对于五花八门的造假掺假等问题显得有些滞后,很多方法针对性弱,不能检测出多种物质或者耗时很长,不能用于现场的快速检测。所以生物芯片的开发就显得很有必要,既有利于企业的验收把关,也有利于监管部门的严格监管,保护消费者的利益。

2.1  食源性病原微生物的检测

很多食品营养丰富,是微生物的良好培养基,从农田到餐桌的每一个过程中都可能引起微生物对食品的污染。传统微生物检测主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)技术和聚合酶链式反应(PCR)技术。但ELISA法重复性不好、受自身抗体干扰容易出现假阳性。PCR难以满足对多病毒的检测,易污染及易出现假阳性。生物芯片的高通量、高灵敏度、高特异性等优点是传统检测方法不可比拟的。Huang提出了陈列式CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)生物电信号传感芯片和聚合酶生物芯片的光学酶检测系统对致病性大肠杆菌进行检测。在这种测定方法中,使用4-甲基伞形酮-beta-D-葡糖苷酸作为荧光底物,可检出0.1U/mL的beta-醛酸苷酶,大约相当于106CFU/mL的大肠杆菌细胞。该光学酶检测系统灵敏且快速。Tachibana等发明了可以定量检测病原微生物的一次性自动微流控PCR塑料芯片。为了实现通用性,他采用了环烯烃聚合物作为芯片的基片。该PCR芯片的人体、大肠杆菌、致病大肠杆菌O157的DNA最低检测限度分别为4、0.0019、0.031pg/μL,且均在18min内检出。该研究提供了一种快速、易操作、低成本的PCR检测方法。Manzano等设计了基于深蓝色有机发光二极管的小型高敏感DNA芯片。为了激发荧光共轭的DNA探针对二极管的分子设计进行优化,为获得较高的灵敏度和特异性使用真正的肉类样本进行测试。最后用经典平板方法和分子生物学方法来验证DNA芯片所取得的结果。该有机发光二极管芯片的最低检测限度为0.37ng/μL,在24h内可得到所需结果。

Koo等通过研究得出微流控芯片能精确检测病原微生物的先决条件是:能在生物传感器上高效捕获目标物。他们用被生物素标记的热休克蛋白作为捕获分子,在微流控环境中检测出了单核细胞增生李斯特菌。并且发现当在孵化时施加5min的介电电泳力,可使热休克蛋白的捕获率增加60%。Eom等选取了7种食源性病原体,用他们发明的基于寡核苷酸的芯片检测系统对病原体各自的16SrDNA特定序列进行评估。并用开发的一个二维可视化工具对结果做了验证,证明该系统可用于多种病原体的检测。Ikeda等开发了快速微珠法检测致病细菌的微流控芯片系统。他们选取4种细菌(大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和蜡状芽孢杆菌)作为食源性致病菌的代表菌种。该系统将5个寡核苷酸探针对应的目标细菌的16SrRNA与荧光微珠结合,荧光标记从4种细菌中提取的RNA,并与固定化寡核苷酸探针荧光微珠杂交。用微流控芯片系统分析复式RNA及微珠,3h后可以得出结果。

2.2  生物毒素的检测

在正常情况下,人体有能力化解和排除部分微量的毒素以维持自身健康。一旦平衡被打破,体内毒素得不到及时清除而不断累积,人体则会进入亚健康状态,进而引发多种疾病。生物毒素的检测也是不可或缺的。

Pennacchio等通过表面等离子体共振生物芯片来检测棒曲霉素毒素。棒曲霉素是青霉和黑曲霉属真菌有毒的次生代谢产物,能引起胃溃疡和肠道炎症,常存在于感冒药中。传统的检测方式需要昂贵的分析仪器,该项研究提出了新的竞争免疫测定方法来检测感冒药。试验中很重要的检测方式是表面等离子体共振光学技术。激光诱导生物芯片表面金属附近的探针和目标分子相互作用,很容易测出轻微改变的反射率,从而检测棒曲霉素毒素。Rubina等用水凝胶生物芯片同时检测出了7种金黄色葡萄球菌肠毒素(A、B、C1、D、E、G和I)。该方法先表达纯化重组毒素,产生抗毒素的单克隆抗体。设计制造出可以筛选单克隆抗体及最优毒素抗体的生物芯片。最后再设计可以定量分析毒素的诊断生物芯片。若在芯片表面涂金属涂层可缩短2h的检测时间。

Pandey等用酿酒酵母全细胞型电容式生物芯片检测不同形式碳纳米管的毒性。该芯片置于不同浓度的单壁、多壁和双壁碳纳米管中,在交流频率下测定动态细胞表面电荷分布相对电容的变化。该芯片与碳纳米管吸附力有很大关系。发达国家生产的该芯片可用于食品和环境样品的高通量筛选。Ahn等构造了基因毒性细胞阵列芯片进行遗传毒性试验,8个重组发光细菌被成功地用来制作基因毒性细胞阵列芯片,用4个有明显化学损伤的DNA来验证该芯片的功能。根据遗传毒性作用的具体过程,每个芯片的菌株都有明显反应。该芯片可以用来研究食品、药物或环境中未知物质的遗传毒性机制。Jimena等用自动化微列阵芯片提取生咖啡中的赭曲霉素A,并用化学发光检测法检测由可再生免疫生物芯片筛选出的赭曲霉素A。他们通过接触式点样,合成了一种共价固定在玻璃芯片上的与水溶性肽共轭羧基化的赭曲霉素A。该芯片可用间接竞争免疫来测定赭曲霉素A。

2.3  残留农兽药的检测

不管何种食品中残留有抗生素,均会严重影响食品的品质。食用抗生素使得人体内有益菌被抑制、致病菌产生耐药性。“无抗奶”是一个通用的国际化原料奶的收购标准,其他食品中也有对抗生素限制的标准。

Gaudin等根据欧洲指南中检测兽药残留方法,用生物芯片技术检验了6种蜂蜜中的抗生素。蜂蜜没有任何抗生素最大残留限量标准,Gaudin参考了2007年出版的欧盟标准实验室的控制方法和分析性能中关于蜂蜜中的抗生素残留控制的策略,用竞争化学发光免疫分析检测抗菌药物。特异性优良,且适用于不同种类的蜂蜜。同样是对蜂蜜中抗生素的检测,Mahony等用化学发光的生物芯片阵列传感技术检测蜂蜜中硝基呋喃类抗生素的残留。使用多路复用的方法,能同时检测4个主要的硝基呋喃类抗生素代谢物。最后用高效液相色谱二级质谱对测定结果进行验证。这个生物传感器法具有发展潜力,适合作为一个在食品安全方面的目的筛选技术。

Kloth等设计了间接竞争化学发光免疫芯片法,仅需要几分钟就可同时检测牛奶中13种抗生素的含量。他们对片基采取了多步化学处理后,最终在玻片表面修饰上环氧树脂活化的PEG层,然后加入磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类等的衍生物,直接与环氧树脂进行共价结合。该方法灵敏度较高,且可重复使用50次,增加了测定的稳定性和便捷性,且减少重新制备片基的成本。

 

作者:苗小草陈万义张娟游春苹

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